特許ウォッチ

公開番号2024156658
公報種別公開特許公報(A)
公開日2024-11-06
出願番号2024103605,2020559426
出願日2024-06-27,2019-04-24
発明の名称ゲノム編集方法及び組成物
出願人リガンダル・インコーポレイテッド
代理人弁理士法人鈴榮特許綜合事務所
主分類C12N 15/09 20060101AFI20241029BHJP(生化学;ビール;酒精;ぶどう酒;酢;微生物学;酵素学;突然変異または遺伝子工学)
要約【課題】複数のペイロードを伴う送達媒体を使用するゲノム編集の方法または組成物を提供する。
【解決手段】送達媒体は、(a)ゲノムを切断する1つ以上の配列特異的ヌクレアーゼ又はこれをコードする1つ以上の核酸;(b)ゲノムに挿入されるヌクレオチド配列を含み、前記ヌクレオチド配列の挿入がゲノム内の挿入部位において部位特異的リコンビナーゼのための標的配列をもたらす第1のドナーDNA;(c)部位特異的リコンビナーゼ又はこれをコードする核酸であって、前記標的配列を認識する部位特異的リコンビナーゼ;及び(d)部位特異的リコンビナーゼによる前記標的配列の認識の結果としてゲノムに挿入されるヌクレオチド配列を含む第2のドナーDNAを含むペイロードを含む。
【選択図】図1
特許請求の範囲【請求項１】
ドナー配列を細胞のゲノムに挿入する方法であって、
（ａ）１つ以上の配列特異的ヌクレアーゼ又は前記１つ以上の配列特異的ヌクレアーゼをコードする１つ以上の核酸を含み、前記１つ以上の配列特異的ヌクレアーゼが前記ゲノムを切断する、ヌクレアーゼ組成物；
（ｂ）前記ゲノムに挿入されるヌクレオチド配列を含む第１のドナーＤＮＡを含み、前記ヌクレオチド配列の挿入が前記ゲノム内の挿入部位において部位特異的リコンビナーゼのための標的配列をもたらす、標的ドナー組成物；
（ｃ）前記部位特異的リコンビナーゼ又は前記部位特異的リコンビナーゼをコードする核酸を含み、前記部位特異的リコンビナーゼが前記標的配列を認識する、リコンビナーゼ組成物；及び
（ｄ）前記部位特異的リコンビナーゼによる前記標的配列の認識の結果として前記ゲノムに挿入されるヌクレオチド配列を含む第２のドナーＤＮＡを含むインサートドナー組成物
を含むペイロードを伴う送達媒体を細胞に導入することを含む方法。
続きを表示（約 1,000 文字）【請求項２】
前記標的ドナー組成物の前記第１のドナーＤＮＡの前記ヌクレオチド配列の挿入が、前記ゲノム内の第１の部位において前記部位特異的リコンビナーゼのための第１の標的配列をもたらし、前記ゲノム内の第２の部位において前記部位特異的リコンビナーゼのための第２の標的配列をもたらす、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ヌクレアーゼ組成物が２か所で前記ゲノムを切断し、前記標的ドナー組成物が前記第１のドナーＤＮＡのうちの２つを含み、それらの各々が前記ゲノムに挿入されるヌクレオチド配列を含み、これにより、前記ゲノム内の第１の部位において前記部位特異的リコンビナーゼのための第１の標的配列をもたらし、前記ゲノム内の第２の部位において前記部位特異的リコンビナーゼのための第２の標的配列をもたらす、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記ゲノム内の前記第１の部位及び第２の部位の間隔が１，０００，０００塩基対以下である、請求項２又は３に記載の方法。
【請求項５】
前記ゲノム内の前記第１の部位及び第２の部位の間隔が１００，０００塩基対以下である、請求項２又は３に記載の方法。
【請求項６】
前記ゲノムに挿入される前記インサートドナー組成物の前記ヌクレオチド配列の長さが、１０塩基対（ｂｐ）～１００キロ塩基対（ｋｂｐ）である、請求項２又は３に記載の方法。
【請求項７】
前記第２のドナーＤＮＡが前記部位特異的リコンビナーゼのための２つの標的配列を含み、前記２つの標的配列が前記ゲノムに挿入される前記ヌクレオチド配列を挟む、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記部位特異的リコンビナーゼのための前記標的配列が、ａｔｔＢ部位、ａｔｔＰ部位、ａｔｔＬ部位、ａｔｔＲ部位、ｌｏｘＰ部位及びＦＲＴ部位から選択される、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記部位特異的リコンビナーゼが、ΦＣ３１、ΦＣ３１ＲＤＦ、Ｃｒｅ及びＦＬＰから選択される、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記１つ以上の配列特異的ヌクレアーゼのうちの少なくとも１つが、メガヌクレアーゼ、ホーミングエンドヌクレアーゼ、亜鉛フィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）及び転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）から選択される、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。
（【請求項１１】以降は省略されています）
発明の詳細な説明【技術分野】
【０００１】
相互参照
本出願は、2018年4月24日に出願された米国特許仮出願第62/661,992号、2018年6月14日に出願された米国特許仮出願第62/685,240号の利益を主張し、これらの出願は、参照によりその全体がここに組み込まれる。
続きを表示（約 9,600 文字）【０００２】
序説
ゲノム編集は、多くの状況で、依然として非効率的な方法である。部位特異的な遺伝子編集を行う多くの方法があるが、治療への橋渡しは、特に、in vivoへの送達を考慮した場合、送達技術が十分ではないことにより妨げられている。効率的なゲノム編集のための組成物及び方法に対する解決されていない重要な要求がある。
【発明の概要】
【０００３】
複数のペイロードを伴う送達媒体を使用するゲノム編集のための組成物及び方法が提供される。一部の態様では、本発明の方法は送達媒体を細胞に導入することを含み、ここで、送達媒体は、（ａ）ゲノムを切断する１つ以上の配列特異的ヌクレアーゼ（例えば、メガヌクレアーゼ、ホーミングエンドヌクレアーゼ、亜鉛フィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、ＴＡＬＥＮ、Ｉ型又はＩＩＩ型のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ切断複合体、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクタータンパク質クラス２（ＲＮＡ誘導型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓポリペプチド（例．Ｃａｓ９、ＣａｓＸ、ＣａｓＹ、Ｃｐｆ１（Ｃａｓ１２ａ）、Ｃａｓ１３、ＭＡＤ７など））、又は１つ以上の配列特異的ヌクレアーゼをコードする１つ以上の核酸［本明細書では（ａ）はヌクレアーゼ組成物という］；（ｂ）ゲノムに挿入されるヌクレオチド配列を含み、前記ヌクレオチド配列の挿入がゲノム内の挿入部位において部位特異的リコンビナーゼのための標的配列（例．ａｔｔＰ部位）をもたらす第１のドナーＤＮＡ［本明細書では（ｂ）は標的ドナー組成物という］；（ｃ）部位特異的リコンビナーゼ（例．ΦＣ３１、ΦＣ３１ＲＤＦ、Ｃｒｅ、ＦＬＰ）（又はこれをコードする核酸）であって、前記標的配列を認識する部位特異的リコンビナーゼ［本明細書では（ｃ）はリコンビナーゼ組成物という］；及び（ｄ）部位特異的リコンビナーゼによる前記標的配列の認識の結果としてゲノムに挿入されるヌクレオチド配列を含む第２のドナーＤＮＡ［本明細書ではｄ）はインサートドナー組成物という］を含むペイロードを含む。（ａ）、（ｂ）、（ｃ）及び（ｄ）を含む送達媒体は、部位特異的リコンビナーゼのための１つ以上の標的部位の挿入による大型の配列のゲノムへの挿入と、その後の目的のヌクレオチド配列のリコンビナーゼ媒介型挿入を容易とする。一部の場合、挿入される（インサートドナー組成物から）目的のヌクレオチド配列は、１０キロ塩基対（ｋｂｐ）以上（例えば、１５ｋｂｐ～１００ｋｂｐ、３０ｋｂｐ～１００ｋｂｐ又は５０ｋｂｐ～１００ｋｂｐ）である。
【０００４】
一部の場合、第１のドナーＤＮＡのヌクレオチド配列の挿入は、ゲノム内の第１の部位において部位特異的リコンビナーゼのための第１の標的配列をもたらし、ゲノム内の第２の部位において部位特異的リコンビナーゼのための第２の標的配列（例えば、２つのａｔｔＰ部位の挿入）をもたらす。一部の場合、ヌクレアーゼ組成物は２か所でゲノムを切断し、標的ドナー組成物は第１のドナーＤＮＡのうちの２つを含み、それらの各々がゲノムに挿入されるヌクレオチド配列を含み、これにより、ゲノム内の第１の部位において部位特異的リコンビナーゼのための第１の標的配列をもたらし、ゲノム内の第２の部位において部位特異的リコンビナーゼのための第２の標的配列をもたらす（例．２つのａｔｔＰ部位の挿入）。一部の場合、第２のドナーＤＮＡは部位特異的リコンビナーゼのための２つの標的配列（例．ａｔｔＢ部位）を含み、ここで、２つの標的配列はゲノムに挿入されるヌクレオチド配列を挟む。
【０００５】
送達媒体は、in vitro、ex vivo又はin vivoで、細胞に導入されうる／細胞へと送達されうる。複数のペイロードを同じ送達媒体（例．ナノ粒子）の一部として送達することの１つの利点は、各ペイロードの効率が低下しないことである。例として、ペイロードＡ及びペイロードＢが２つの別個のパッケージ／媒体（それぞれパッケージＡ及びパッケージＢ）により送達される場合、効率は乗算的で、例えば、パッケージＡ及びパッケージＢが各々１％のトランスフェクション効率を有する場合、ペイロードＡ及びペイロードＢを同じ細胞へと送達する見込みは０．０１％（１％×１％）である。しかし、ペイロードＡ及びペイロードＢがいずれも同じ送達媒体の一部として送達される場合、ペイロードＡ及びペイロードＢを同じ細胞へと送達する見込みは１％で、０．０１％に対して１００倍の改善である。
【０００６】
送達媒体は、非ウイルス性媒体、ウイルス性媒体、ナノ粒子（例．ターゲティングリガンド、並びに／又はアニオン性ポリマー組成物、カチオン性ポリマー組成物及びカチオン性ポリペプチド組成物を含むコア、を含むナノ粒子）、リポソーム、ミセル、水中油中水エマルジョン粒子、水中油エマルジョンミセル粒子、多重膜型水中油中水エマルジョン粒子、帯電ポリマーであるポリペプチドドメインと結合したターゲティングリガンド（例．ペプチドのターゲティングリガンド。ここで、ターゲティングリガンドは細胞表面タンパク質と結合し、そして、帯電ポリマーであるポリペプチドドメインは、核酸ペイロードと凝縮する及び／又はタンパク質ペイロードと静電相互作用している）、ペイロードと結合したターゲティングリガンド（例．ペプチドであるターゲティングリガンド。ここで、ターゲティングリガンドは細胞表面タンパク質と結合する）などを含みうるが、これらに限定されるものではない。一部の場合、ペイロードは、デオキシリボヌクレオタンパク質複合体及び／又はリボ－デオキシリボヌクレオタンパク質複合体として細胞に導入される。
【０００７】
提供される組成物及び方法は、任意の細胞内の任意の座位におけるゲノム編集のために（例えばin vivoにおいて、例えばＴ細胞を操作するのに）使用されうる。例えば、ＣＤ８＋Ｔ細胞集団又はＣＤ８＋及びＣＤ４＋Ｔ細胞の混合物は、抗原認識のために、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及び／又はＣＤＲ３ドメインの適切なＴＣＲα／ＴＣＲβ対を一過性又は恒久的に発現するようにプログラム化されうる。
【０００８】
本発明は、添付した図面を参照する場合に、以下の発明の詳細な説明を最も良く理解することができる。一般的な慣行に従い、図面は必ずしも縮尺どおりではないことが強調される。対照的に、図面は、明確さのために任意に拡大又は縮小することができる。図面には以下の図が含まれる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
図１は、本発明の方法を例示する概略図である。この例では、配列特異的ヌクレアーゼによるゲノムの切断の後に、（標的ドナー組成物のドナーＤＮＡを使用して）２つの標的配列（例．ａｔｔＰ部位）をゲノムに挿入する。２つの標的配列（例．ａｔｔＢ部位）はインサートドナー組成物のドナーＤＮＡ上に存在しており、部位特異的リコンビナーゼ（例．ΦＣ３１）を使用して（インサートドナー組成物の）ドナーＤＮＡの配列を挿入した後も、２つの残留部位（例．ａｔｔＲ部位）はゲノム内に存在している。
図２は、送達媒体（この例では、ある種のナノ粒子）を例示する概略図である。
図３は、送達媒体（この例では、ある種のナノ粒子）を例示する概略図である。この場合、ナノ粒子は、外側から順に、表面コート（外殻を含む）層、第２の脱落層、中間層（追加のペイロードを含む）及び第１の脱落層により取り囲まれたコア（第１のペイロードを含む）を有する、多層型である。
図４（パネルＡ～Ｂ）は、本発明のナノ粒子の表面コートにおけるターゲティングリガンドの構成例を示す概略図である。図示された送達分子は、ナノ粒子の脱落層と静電相互作用しているアンカードメインとコンジュゲートしたターゲティングリガンドを含む。ターゲティングリガンドは、Ｎ末端又はＣ末端でコンジュゲートする場合（各パネルの左側）も、内部でコンジュゲートする場合（各パネルの右側）もあることに留意されたい。パネルＡではリンカーを含んでいるが、パネルＢはリンカーを含まない。
図５Ａは、送達媒体（本発明の送達分子を構成する例）を例示する概略図である。ターゲティングリガンドは、Ｎ末端又はＣ末端でコンジュゲートする場合（各パネルの左側）も、内部でコンジュゲートする場合（各パネルの右側）もある。この図は、リンカーのほかにペイロードと結合したターゲティングリガンドを含む送達分子を示す。
図５Ｂは、送達媒体（本発明の送達分子を構成する例）を例示する概略図である。ターゲティングリガンドは、Ｎ末端又はＣ末端でコンジュゲートする場合（各パネルの左側）も、内部でコンジュゲートする場合（各パネルの右側）もある。この図は、リンカーを有さないがペイロードと結合したターゲティングリガンドを有する送達分子を示す。
図５Ｃは、送達媒体（本発明の送達分子を構成する例）を例示する概略図である。ターゲティングリガンドは、Ｎ末端又はＣ末端でコンジュゲートする場合（各パネルの左側）も、内部でコンジュゲートする場合（各パネルの右側）もある。この図は、核酸ペイロードと凝縮した（及び／又はタンパク質ペイロードと例えば静電的に相互作用している）帯電ポリマーであるポリペプチドドメインと結合した、リンカー及びターゲティングリガンドを含む送達分子を示す。
図５Ｄは、送達媒体（本発明の送達分子を構成する例）を例示する概略図である。ターゲティングリガンドは、Ｎ末端又はＣ末端でコンジュゲートする場合（各パネルの左側）も、内部でコンジュゲートする場合（各パネルの右側）もある。この図は、リンカーは有さないが、核酸ペイロードと凝縮した（及び／又はタンパク質ペイロードと例えば静電的に相互作用している）帯電ポリマーであるポリペプチドドメインと結合したターゲティングリガンドを含む送達分子を示す。
図６は、使用可能な（例えばナノ粒子の一部として、例えば核局在化シグナル（ＮＬＳ）含有ペプチドとして；ＮＬＳ含有ペプチド、アニオン性ポリマー、カチオン性ポリマー及び／又はカチオン性ポリペプチドなどの一部として／これらにコンジュゲート可能な）ＮＬＳの例を示す。図は、Kosugi et al., J Biol Chem. 2009 Jan 2;284(1):478-85からの転載である［クラス１、上から順に配列番号２０１から配列番号２２１；クラス２、上から順に配列番号２２２から配列番号２２４；クラス４、上から順に配列番号２２５から配列番号２３０；クラス３、上から順に配列番号２３１から配列番号２４５；クラス５、上から順に配列番号２４６から配列番号２６４］。
図７は、マウス造血細胞系統と当該系統内の多様な細胞で同定されたマーカーを示す概略図である。
図８は、ヒト造血細胞系統と当該系統内の多様な細胞で同定されたマーカーを示す概略図である。
図９は、細胞の分化及び／又は増殖に影響を及ぼすのに使用可能なｍｉＲＮＡを示す概略図である。
図１０は、細胞の分化及び／又は増殖に影響を及ぼすのに使用可能なタンパク質を示す概略図である。
図１１は、研究Ａの組成物に関して、ナノ粒子の平均粒子サイズを示す。
図１２は、研究Ａの組成物に関して、ナノ粒子のゼータ電位を示す。
図１３は、研究Ａの組成物に関して、ナノ粒子の多分散性指数を示す。
図１４は、研究Ｂの組成物に関して、ナノ粒子の多分散性指数及び安定性を説明する図を示す。
図１５は、研究Ｂの組成物に関して、ナノ粒子の平均粒子サイズを示す。
図１６は、研究Ｂの組成物に関して、ナノ粒子のゼータ電位を示す。
図１７は、研究Ｂの組成物に関して、ナノ粒子の多分散性指数を示す。
図１８は、研究Ｂの組成物に関して、ナノ粒子の多分散性指数及び安定性を説明する図を示す。
図１９は、研究Ｃの組成物に関して、ナノ粒子の粒子サイズ分布を示す。
図２０は、研究Ｃの組成物に関して、ナノ粒子のゼータ電位を示す。
図２１は、研究Ｃの組成物に関して、ナノ粒子の多分散性指数を示す。
図２２は、研究Ｃの組成物に関して、ナノ粒子の多分散性指数及び安定性を示す。
図２３は、研究Ｃの組成物に関して、ナノ粒子のSYBR GOLD組入れアッセイで得た蛍光値を示す。
図２４は、ＲＮＰ－Ｈ２Ｂ（ミニコア）粒子についての特徴付けを示す。
図２５は、ＲＮＰ－Ｈ２Ｂ－ＰＬＥ２０：ＰＤＥ２０（コア）粒子についての特徴付けを示す。
図２６は、ＲＮＰ－Ｈ２Ｂ－ＰＬＥ２０：ＰＤＥ２０（コア）粒子の血清安定性を示す。
図２７は、１日後のリガンド修飾粒子についての多分散性の評価を示す。
図２８は、７２時間後又は７日後のリガンド修飾粒子についての多分散性の評価を示す。
図２９は、自動式パイプラインサンプリングで測定される細胞、核及びナノ粒子を示す。
図３０は、さまざまな処理の１４．５時間後までの細胞内の粒子の共局在の変化を示す。
図３１は、さまざまな処理の１４．５時間後までのＣａｓ９－ｅＧＦＰ細胞の割合を示す。
図３２は、さまざまな処理の１４．５時間後までの核への粒子の組込みを示す。
図３３は、さまざまな処理の１４．５時間後までのＣａｓ９－ｅＧＦＰ細胞の割合を示す。
図３４Ａは、非処理試料中のＴ細胞及びＰＢＭＣのターゲティングを示す。
図３４Ｂは、図３４Ａに対応するヒト初代汎Ｔ細胞データを示す。
図３４Ｃは、図３４Ａに対応するヒト初代ＰＢＭＣデータを示す。
図３５Ａは、コア粒子中のＴ細胞及びＰＢＭＣのターゲティングを示す。
図３５Ｂは、図３５Ａに対応するヒト初代汎Ｔ細胞データを示す。
図３５Ｃは、図３５Ａに対応するヒト初代ＰＢＭＣデータを示す。
図３６Ａは、リガンドであるポリ（L-アルギニン）で処理された試料中のＴ細胞及びＰＢＭＣのターゲティングを示す。
図３６Ｂは、図３６Ａに対応するヒト初代汎Ｔ細胞データを示す。
図３６Ｃは、図３６Ａに対応するヒト初代ＰＢＭＣデータを示す。
図３７Ａは、リガンドＣＤ３＿ＣＤ３ｅ＿（４ＧＳ）２＿９Ｒ＿Ｎ＿１による、試料中のＴ細胞及びＰＢＭＣのターゲティングを示す。
図３７Ｂは、図３７Ａに対応するヒト初代汎Ｔ細胞データを示す。
図３７Ｃは、図３７Ａに対応するヒト初代ＰＢＭＣデータを示す。
図３８Ａは、リガンドＣＤ８＿（４ＧＳ）２＿９Ｒ＿Ｎによる、試料中のＴ細胞及びＰＢＭＣのターゲティングを示す。
図３８Ｂは、図３８Ａに対応するヒト初代汎Ｔ細胞データを示す。
図３８Ｃは、図３８Ａに対応するヒト初代ＰＢＭＣデータを示す。
図３９Ａは、リガンドＣＤ２８＿ｍＣＤ８０＿（４ＧＳ）２＿９Ｒ＿Ｎによる、試料中のＴ細胞及びＰＢＭＣのターゲティングを示す。
図３９Ｂは、図３９Ａに対応するヒト初代汎Ｔ細胞データを示す。
図３９Ｃは、図３９Ａに対応するヒト初代ＰＢＭＣデータを示す。
図４０Ａは、リガンドＣＤ２８＿ｍＣＤ８６＿（４ＧＳ）２＿９Ｒ＿Ｎによる、試料中のＴ細胞及びＰＢＭＣのターゲティングを示す。
図４０Ｂは、図４０Ａに対応するヒト初代汎Ｔ細胞データを示す。
図４０Ｃは、図４０Ａに対応するヒト初代ＰＢＭＣデータを示す。
図４１Ａは、リガンドＩＬ２Ｒ＿ｍＩＬ２＿４ＧＳ＿２＿９Ｒ＿Ｎ＿１による、試料中のＴ細胞及びＰＢＭＣのターゲティングを示す。
図４１Ｂは、図４１Ａに対応するヒト初代汎Ｔ細胞データを示す。
図４１Ｃは、図４１Ａに対応するヒト初代ＰＢＭＣデータを示す。
図４２Ａは、リガンドＣＤ３＿ＣＤ３ｅ＿（４ＧＳ）２＿９Ｒ＿Ｎ＿１及びＣＤ８＿（４ＧＳ）２＿９Ｒ＿Ｎによる、試料中のＴ細胞及びＰＢＭＣのターゲティングを示す。
図４２Ｂは、図４２Ａに対応するヒト初代汎Ｔ細胞データを示す。
図４２Ｃは、図４２Ａに対応するヒト初代ＰＢＭＣデータを示す。
図４３Ａは、リガンドＣＤ３＿ＣＤ３ｅ＿（４ＧＳ）２＿９Ｒ＿Ｎ＿１及びＣＤ２８＿ｍＣＤ８０＿（４ＧＳ）２＿９Ｒ＿Ｎによる、試料中のＴ細胞及びＰＢＭＣのターゲティングを示す。
図４３Ｂは、図４３Ａに対応するヒト初代汎Ｔ細胞データを示す。
図４３Ｃは、図４３Ａに対応するヒト初代ＰＢＭＣデータを示す。
図４４Ａは、リガンドＣＤ３＿ＣＤ３ｅ＿（４ＧＳ）２＿９Ｒ＿Ｎ＿１及びＣＤ２８＿ｍＣＤ８６＿（４ＧＳ）２＿９Ｒ＿Ｎによる、試料中のＴ細胞及びＰＢＭＣのターゲティングを示す。
図４４Ｂは、図４４Ａに対応するヒト初代汎Ｔ細胞データを示す。
図４４Ｃは、図４４Ａに対応するヒト初代ＰＢＭＣデータを示す。
図４５Ａは、リガンドＣＤ３＿ＣＤ３ｅ＿（４ＧＳ）２＿９Ｒ＿Ｎ＿１及びＩＬ２Ｒ＿ｍＩＬ２＿４ＧＳ＿２＿９Ｒ＿Ｎ＿１による、試料中のＴ細胞及びＰＢＭＣのターゲティングを示す。
図４５Ｂは、図４５Ａに対応するヒト初代汎Ｔ細胞データを示す。
図４５Ｃは、図４５Ａに対応するヒト初代ＰＢＭＣデータを示す。
図４６Ａは、リガンドＣＤ３＿ＣＤ３ｅ＿（４ＧＳ）２＿９Ｒ＿Ｎ＿１及びポリ（L-アルギニン）；ｎ＝１０による、試料中のＴ細胞及びＰＢＭＣのターゲティングを示す。
図４６Ｂは、図４６Ａに対応するヒト初代汎Ｔ細胞データを示す。
図４６Ｃは、図４６Ａに対応するヒト初代ＰＢＭＣデータを示す。
図４７Ａは、リガンドＣＤ２８＿ｍＣＤ８０＿（４ＧＳ）２＿９Ｒ＿Ｎ及びＣＤ２８＿ｍＣＤ８６＿（４ＧＳ）２＿９Ｒ＿Ｎによる、試料中のＴ細胞及びＰＢＭＣのターゲティングを示す。
図４７Ｂは、図４７Ａに対応するヒト初代汎Ｔ細胞データを示す。
図４７Ｃは、図４７Ａに対応するヒト初代ＰＢＭＣデータを示す。
図４８Ａは、リガンドＣＤ３＿ＣＤ３ｅ＿（４ＧＳ）２＿９Ｒ＿Ｎ＿１、ＣＤ２８＿ｍＣＤ８６＿（４ＧＳ）２＿９Ｒ＿Ｎ及びＣＤ８＿４ＧＳ＿２＿９Ｒ＿Ｎ＿１による、試料中のＴ細胞及びＰＢＭＣのターゲティングを示す。
図４８Ｂは、図４８Ａに対応するヒト初代汎Ｔ細胞データを示す。
図４８Ｃは、図４８Ａに対応するヒト初代ＰＢＭＣデータを示す。
図４９Ａは、リガンドＣＤ３＿ＣＤ３ｅ＿（４ＧＳ）２＿９Ｒ＿Ｎ＿１、ＣＤ８＿４ＧＳ＿２＿９Ｒ＿Ｎ＿１及びＩＬ２Ｒ＿ｍＩＬ２＿４ＧＳ＿２＿９Ｒ＿Ｎ＿１による、試料中のＴ細胞及びＰＢＭＣのターゲティングを示す。
図４９Ｂは、図４９Ａに対応するヒト初代汎Ｔ細胞データを示す。
図４９Ｃは、図４９Ａに対応するヒト初代ＰＢＭＣデータを示す。
図５０Ａは、リガンドＣＤ３＿ＣＤ３ｅ＿（４ＧＳ）２＿９Ｒ＿Ｎ＿１、ＣＤ２８＿ｍＣＤ８０＿（４ＧＳ）２＿９Ｒ＿Ｎ及びＣＤ８＿４ＧＳ＿２＿９Ｒ＿Ｎ＿１による、試料中のＴ細胞及びＰＢＭＣのターゲティングを示す。
図５０Ｂは、図５０Ａに対応するヒト初代汎Ｔ細胞データを示す。
図５０Ｃは、図５０Ａに対応するヒト初代ＰＢＭＣデータを示す。
図５１Ａは、ＣＤ３＿ＣＤ３ｅ＿（４ＧＳ）２＿９Ｒ＿Ｎ＿１、ＣＤ２８＿ｍＣＤ８６＿（４ＧＳ）２＿９Ｒ＿Ｎ及びＣＤ２８＿ｍＣＤ８０＿（４ＧＳ＿）２＿９Ｒ＿Ｎ＿１による、試料中のＴ細胞及びＰＢＭＣのターゲティングを示す。
図５１Ｂは、図５１Ａに対応するヒト初代汎Ｔ細胞データを示す。
図５１Ｃは、図５１Ａに対応するヒト初代ＰＢＭＣデータを示す。
図５２Ａは、リガンドＣＤ８＿４ＧＳ＿２＿９Ｒ＿Ｎ＿１、ＣＤ２８＿ｍＣＤ８０＿（４ＧＳ）２＿９Ｒ＿Ｎ及びＣＤ２８＿ｍＣＤ８６＿（４ＧＳ）２＿９Ｒ＿Ｎによる、試料中のＴ細胞及びＰＢＭＣのターゲティングを示す。
図５２Ｂは、図５２Ａに対応するヒト初代汎Ｔ細胞データを示す。
図５２Ｃは、図５２Ａに対応するヒト初代ＰＢＭＣデータを示す。
図５３Ａは、リガンドＣＤ８＿４ＧＳ＿２＿９Ｒ＿Ｎ＿１、ＣＤ２８＿ｍＣＤ８０＿（４ＧＳ）２＿９Ｒ＿Ｎ及びＩＬ２Ｒ＿ｍＩＬ２＿４ＧＳ＿２＿９Ｒ＿Ｎ＿１による、試料中のＴ細胞及びＰＢＭＣのターゲティングを示す。
図５３Ｂは、図５３Ａに対応するヒト初代汎Ｔ細胞データを示す。
図５３Ｃは、図５３Ａに対応するヒト初代ＰＢＭＣデータを示す。
図５４Ａは、リガンドＣＤ８＿４ＧＳ＿２＿９Ｒ＿Ｎ＿１、ＣＤ２８＿ｍＣＤ８６＿（４ＧＳ）２＿９Ｒ＿Ｎ、ＩＬ２Ｒ＿ｍＩＬ２＿４ＧＳ＿２＿９Ｒ＿Ｎ＿１による、試料中のＴ細胞及びＰＢＭＣのターゲティングを示す。
図５４Ｂは、図５４Ａに対応するヒト初代汎Ｔ細胞データを示す。
図５４Ｃは、図５４Ａに対応するヒト初代ＰＢＭＣデータを示す。
図５５は、異なるリガンドによる試料の画像解析、汎Ｔ細胞フロー解析及びＰＢＭＣフロー解析を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
上記にまとめたとおり、複数のペイロードを伴う送達媒体を使用するゲノム編集のための組成物及び方法が提供される。一部の態様では、本発明の方法は送達媒体を細胞に導入することを含み、ここで、送達媒体は、（ａ）ゲノムを切断する１つ以上の配列特異的ヌクレアーゼ（例えば、メガヌクレアーゼ、ホーミングエンドヌクレアーゼ、亜鉛フィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、ＴＡＬＥＮ、Ｉ型又はＩＩＩ型のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ切断複合体、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクタータンパク質クラス２（ＲＮＡ誘導型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓポリペプチド（例．Ｃａｓ９、ＣａｓＸ、ＣａｓＹ、Ｃｐｆ１（Ｃａｓ１２ａ）、Ｃａｓ１３、ＭＡＤ７など））、又は１つ以上の配列特異的ヌクレアーゼをコードする１つ以上の核酸［本明細書では（ａ）はヌクレアーゼ組成物という］；（ｂ）ゲノムに挿入されるヌクレオチド配列を含み、前記ヌクレオチド配列の挿入がゲノム内の挿入部位において部位特異的リコンビナーゼのための標的配列（例．ａｔｔＰ部位）をもたらす第１のドナーＤＮＡ［本明細書では（ｂ）は標的ドナー組成物という］；（ｃ）部位特異的リコンビナーゼ（例．ΦＣ３１、ΦＣ３１ＲＤＦ、Ｃｒｅ、ＦＬＰ）（又はこれをコードする核酸）であって、前記標的配列を認識する部位特異的リコンビナーゼ［本明細書では（ｃ）はリコンビナーゼ組成物という］；及び（ｄ）部位特異的リコンビナーゼによる前記標的配列の認識の結果としてゲノムに挿入されるヌクレオチド配列を含む第２のドナーＤＮＡ［本明細書では（ｄ）はインサートドナー組成物という］を含むペイロードを含む。
（【００１１】以降は省略されています）

関連特許