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公開番号2024150853
公報種別公開特許公報(A)
公開日2024-10-24
出願番号2023063850
出願日2023-04-11
発明の名称RNAの検出方法
出願人東レ株式会社
代理人
主分類C12Q 1/6816 20180101AFI20241017BHJP(生化学;ビール;酒精;ぶどう酒;酢;微生物学;酵素学;突然変異または遺伝子工学)
要約【課題】本発明は、RNAを高感度かつ特異的に検出することを目的とする。
【解決手段】本発明は、56℃で5分間加温することで活性が50%以下に低下する脱リン酸化酵素で検出対象となるRNAの5’末端を脱リン酸化し、前記酵素を60℃以上80℃以下で失活させ、テトラアルキルアンモニウム塩存在下ハイブリダイゼーションを行う工程を経ることを特徴とするRNAの検出方法である。
【選択図】なし
特許請求の範囲【請求項１】
試料中のＲＮＡを検出する方法であって
工程ａ）：前記試料に脱リン酸化酵素を作用させて前記ＲＮＡの５’末端のリン酸基を除去する工程、
工程ｂ）：工程ａ）で得られた反応液を６０℃以上８０℃以下に加温し、前記脱リン酸化酵素を失活させる工程、および
工程ｃ）：工程ｂ）で得られた反応液を、テトラアルキルアンモニウム塩存在下、前記ＲＮＡを捕捉可能なプローブＤＮＡに接触させて、当該ＲＮＡと前記プローブＤＮＡとをハイブリダイゼーションさせる工程
を含み、
前記脱リン酸化酵素は、５６℃で５分間加温することで酵素活性が５０％以下に低下することを特徴とする、方法。
続きを表示（約 300 文字）【請求項２】
前記ＲＮＡがマイクロＲＮＡである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
テトラアルキルアンモニウム塩がテトラメチルアンモニウムクロリドである、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
テトラアルキルアンモニウム塩及び５６℃で５分間加温することで酵素活性が５０％以下に低下する脱リン酸化酵素を含む、ＲＮＡ検出用のキット。
【請求項５】
検出対象のＲＮＡがマイクロＲＮＡである、請求項４に記載のキット。
【請求項６】
テトラアルキルアンモニウム塩がテトラメチルアンモニウムクロリドである、請求項４または５に記載のキット。

発明の詳細な説明【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＲＮＡの検出方法およびＲＮＡ検出用のキットに関する。
続きを表示（約 2,100 文字）【背景技術】
【０００２】
ＤＮＡマイクロアレイは、支持体上に固相化したプローブＤＮＡと検出対象核酸とのハイブリダイゼーション反応を検出原理としている。より多くの検出対象核酸を捉えるため、複数のプローブＤＮＡを支持体上に固定化して用いるが、精度良く検出するためには、検出対象核酸に特異的な配列を持つように設計したプローブＤＮＡを用いる必要がある。ゲノムＤＮＡやメッセンジャーＲＮＡの検出においては、塩基配列の相同性を指標に、他の分子と相同性の低い領域を選択し、２０塩基～１００塩基程度の長さのプローブＤＮＡを合成して用いることが行われている。また、プローブ設計時には、ハイブリダイゼーション強度の指標であるＴｍ値を計算し、複数のプローブＤＮＡ間でＴｍ値に差が生じないよう工夫されている。
【０００３】
特異的に検出するための別のアプローチとして、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーを高めることで、類似配列のハイブリダイゼーションを抑える方法が行われている。具体的には、ハイブリダイゼーション反応温度や、ハイブリ反応溶液中の塩強度、ホルムアミドの添加等で、適宜調整することができる。
【０００４】
また、ＲＮＡの検出における特異度向上の方法として、テトラメチルアンモニウム塩共存下でＬＡＭＰ法による検出を行うことにより、プライマーとのハイブリダイゼーション配列依存性を低下させることで、検出の特異度を向上させる方法が報告されている（特許文献１）。
【０００５】
近年、ｍｉＲＮＡは、細胞内のみならず、細胞を含まない検体である血清、血漿、尿、脊髄液等の体液にも多く存在し、その存在量が、がんをはじめとした様々な疾患のバイオマーカーとなる可能性が示唆されている。ｍｉＲＮＡはヒトにおいて２６００種以上が存在し、高感度なＤＮＡマイクロアレイ等の測定系を利用した場合、そのうちの１０００種を超えるｍｉＲＮＡの発現を血清・血漿中で同時に検出することが可能である。そこで、ＤＮＡマイクロアレイを用いて血清・血漿、尿、脊髄液等の体液を対象としたバイオマーカー探索研究が実施されており、疾患を早期に発見できるバイオマーカー検査への展開が期待されている。ｍｉＲＮＡの検出精度について、マイクロアレイを含むいくつかの検出技術を用いた比較評価がなされている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
特開２００８－２７８７７９号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
ＲＮＡ検出の特異性を高めるため、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーを高くすると、Ｔｍ値の低いＲＮＡが検出できなくなる。このためマイクロアレイでＲＮＡを特異的に検出することと、多くのＲＮＡを検出できる感度を両立させることは、困難であった。特に、ｍｉＲＮＡは１５～２５塩基と短く、特異的な配列を選択してプローブＤＮＡを設計することは困難であることから、プローブ配列による特異性の確保やＴｍ値を揃えることが困難であった。
【０００８】
発明者は、試料中のｍｉＲＮＡを、プローブＤＮＡの固定化された担体と接触させることで検出することを試みた。具体的には、一般的な脱リン酸化酵素であるタカラバイオ社製アルカリホスファターゼ（型番２２５０Ａ）を、試料に作用させて前記ｍｉＲＮＡの５’末端のリン酸基を除去し、得られた反応液を、一般的なアルカリホスファターゼ失活処理温度である１００℃に加温することで、前記アルカリホスファターゼを失活させた。得られた反応液に含まれる当該ｍｉＲＮＡを、Ｔ４ＲＮＡリガーゼによって蛍光色素標識し、得られた反応液を、前記ｍｉＲＮＡを捕捉可能なプローブＤＮＡに接触させて当該ｍｉＲＮＡと前記プローブＤＮＡとをハイブリダイゼーションさせることによって、ｍｉＲＮＡを検出した（比較例１）。しかし、ハイブリダイゼーションの特異性が低いという問題があった。
【０００９】
そこで、特許文献１を参考に、テトラアルキルアンモニウム塩を用いてハイブリダイゼーション配列依存性を低下させることで、ハイブリダイゼーションの特異性を向上させることを試みた。具体的には、前記プローブＤＮＡとのハイブリダイゼーションの工程において、テトラメチルアンモニウムクロリド（ＴＭＡＣ）存在下でハイブリダイゼーションを行うことで検出の特異度の向上を試みた（比較例２）。しかし、この場合は検出感度が低下するという問題が生じた。
【００１０】
このように、ＲＮＡの５’末端脱リン酸化を経る、ハイブリダイゼーションによるＲＮＡの検出において、特にｍｉＲＮＡの検出において、検出の特異度を向上させるためにテトラメチルアンモニウムクロリドを用いた場合、高感度での検出は困難であった。
【課題を解決するための手段】
（【００１１】以降は省略されています）

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