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公開番号2024170270
公報種別公開特許公報(A)
公開日2024-12-06
出願番号2023111963
出願日2023-07-07
発明の名称アデノ随伴ウイルスのスクリーニング方法
出願人東ソー株式会社
代理人
主分類C12N 7/01 20060101AFI20241129BHJP(生化学;ビール;酒精;ぶどう酒;酢;微生物学;酵素学;突然変異または遺伝子工学)
要約【課題】試料中に含まれるアデノ随伴ウイルスを感染能の強さに基づき簡便にスクリーニングする方法を提供すること。
【解決手段】不溶性担体と当該担体に固定化したKIAA0319Lの細胞外領域ドメイン1またはドメイン2に相当するアミノ酸配列を少なくとも含むポリペプチドとを含む吸着剤に試料中に含まれるAAVを吸着させる工程と、前記吸着剤に吸着したAAVを溶出液を用いて溶出させる工程とを含む、AAVのスクリーニング方法により、前記課題を解決する。
【選択図】なし
特許請求の範囲【請求項１】
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）タンパク質をコードするポリヌクレオチドに変異導入し当該ポリヌクレオチド変異体のライブラリを構築する工程と、
前記ライブラリで宿主を形質転換した形質転換体を培養しＡＡＶ変異体を発現させる工程と、
前記ＡＡＶ変異体が有する特性を分析する工程とを含む、ＡＡＶのスクリーニング方法であって、
前記分析する工程が、不溶性担体と当該担体に固定化したＡＡＶ結合性タンパク質とを含むＡＡＶ吸着剤に前記ＡＡＶ変異体を吸着させる工程と、
前記吸着剤に吸着したＡＡＶ変異体を溶出液を用いて溶出させる工程とを少なくとも含む、前記方法。
続きを表示（約 1,000 文字）【請求項２】
特性が細胞への感染能であり、ＡＡＶ結合性タンパク質が以下の（ｉ）から（ｉｉｉ）のいずれかから選択されるポリペプチドである、請求項１に記載の方法；
（ｉ）配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち、３１２番目のセリンから４０１番目のグルタミン酸までのアミノ酸残基または４０９番目のイソロイシンから５００番目のアスパラギン酸までのアミノ酸残基を少なくとも含むポリペプチド、
（ｉｉ）配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち、３１２番目のセリンから４０１番目のグルタミン酸までのアミノ酸残基または４０９番目のイソロイシンから５００番目のアスパラギン酸までのアミノ酸残基を少なくとも含み、ただしこれらアミノ酸残基において、１もしくは数個の位置での１もしくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、または付加を含むアミノ酸配列を有し、かつＡＡＶ結合活性を有するポリペプチド、
（ｉｉｉ）配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち、３１２番目のセリンから４０１番目のグルタミン酸までのアミノ酸残基または４０９番目のイソロイシンから５００番目のアスパラギン酸までのアミノ酸残基を少なくとも含み、ただしこれらアミノ酸残基からなるアミノ酸配列に対して７０％以上の相同性を有し、かつＡＡＶ結合活性を有するポリペプチド。
【請求項３】
ＡＡＶ結合性タンパク質が、以下の（ｉｖ）から（ｖｉ）のいずれかから選択されるポリペプチドである、請求項２に記載の方法；
（ｉｖ）配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち３１２番目のセリンから５００番目のアスパラギン酸までのアミノ酸残基を少なくとも含むポリペプチド、
（ｖ）配列番号１に記載のアミノ酸配列の３１２番目のセリンから５００番目のアスパラギン酸までのアミノ酸残基を少なくとも含み、ただし当該３１２番目から５００番目までのアミノ酸残基において、１もしくは数個の位置での１もしくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、または付加を含むアミノ酸配列を有し、かつＡＡＶ結合活性を有するポリペプチド、
（ｖｉ）配列番号１に記載のアミノ酸配列の３１２番目のセリンから５００番目のアスパラギン酸までのアミノ酸残基を少なくとも含み、ただし当該３１２番目から５００番目までのアミノ酸残基からなるアミノ酸配列に対して７０％以上の相同性を有し、かつＡＡＶ結合活性を有するポリペプチド。
【請求項４】
ＡＡＶ吸着剤が当該吸着剤を充填したカラムの態様である、請求項１から３のいずれかに記載の方法。

発明の詳細な説明【技術分野】
【０００１】
本発明は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）のスクリーニング方法に関する。特に本発明は、所望の特性を有したＡＡＶを簡便にスクリーニング可能な方法に関する。
続きを表示（約 1,400 文字）【背景技術】
【０００２】
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）はパルボウイルス科（Ｐａｒｖｏｖｉｒｉｄａｅ）、ディペンドウイルス属（Ｄｅｐｅｎｄｏｖｉｒｕｓ）に分類される非エンベロープウイルスである。ＡＡＶ外殻粒子は３種類のタンパク質（ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３）で構成されており、約６０のタンパク質分子がおよそＶＰ１：ＶＰ２：ＶＰ３＝１：１：１０の比率で混在し集合することで、直径２０ｎｍから３０ｎｍの正二十面体の形状をしている。
【０００３】
ＡＡＶはヒトを含む広範な種の細胞に感染可能で、血球、筋、神経細胞などの分化を終た非分裂細胞にも感染すること、ヒトに対する病原性がないため副作用の心配が低いこと、ウイルス粒子が物理化学的に安定であること、などから、先天性遺伝子疾患の治療を目的とした遺伝子導入用のベクターとしての利用価値が注目されている。
【０００４】
ＡＡＶタンパク質を構成するポリペプチドのうち特定位置のアミノ酸残基を他のアミノ酸残基に置換することで、ＡＡＶが有する特性が変化したＡＡＶ変異体を取得できる。一例として非特許文献１では、アミノ酸残基未置換のＡＡＶ（野生型ＡＡＶ）に対し細胞への感染能に違いが生じたＡＡＶ変異体を開示している。
【０００５】
このようなＡＡＶが有する特性に基づきスクリーニングする技術は、ＡＡＶを用いた遺伝子治療に関する研究開発を促進させるために必須である。しかし従来の技術は、発現したＡＡＶ変異体の精製および当該精製したＡＡＶ変異体の培養細胞への感染実験を必要とし、非常に煩雑であった。したがって、前記特性に関する簡便なスクリーニング技術が求められていた。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
Ｌｏｃｈｒｉｅ，Ｍ．Ａ．，ｅｔａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌｏｆｖｉｒｏｌｏｇｙ，８０（２），８２１，２００６
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の課題は、所望の特性を有したアデノ随伴ウイルスを簡便にスクリーニング可能な方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは鋭意検討した結果、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）変異体ライブラリを、不溶性担体と当該担体に固定化したＡＡＶ結合性タンパク質とを含む吸着剤を用いて分析することで、当該変異体そのものを精製することなく、当該変異体が有する特性に基づきスクリーニングできることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００９】
すなわち、本発明は以下の［１］から［４］に示す態様を包含する。
【００１０】
［１］ＡＡＶタンパク質をコードするポリヌクレオチドに変異導入し当該ポリヌクレオチド変異体のライブラリを構築する工程と、
前記ライブラリで宿主を形質転換した形質転換体を培養しＡＡＶ変異体を発現させる工程と、
前記ＡＡＶ変異体が有する特性を分析する工程とを含むＡＡＶのスクリーニング方法であって、
前記分析する工程が不溶性担体と当該担体に固定化したＡＡＶ結合性タンパク質とを含むＡＡＶ吸着剤に前記ＡＡＶ変異体を吸着させる工程と、
前記吸着剤に吸着したＡＡＶ変異体を溶出液を用いて溶出させる工程とを少なくとも含む、前記方法。
（【００１１】以降は省略されています）

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