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公開番号2025080627
公報種別公開特許公報(A)
公開日2025-05-26
出願番号2023193906
出願日2023-11-14
発明の名称緩衝剤によるヘムタンパク質の安定化方法
出願人東洋紡株式会社
代理人
主分類C12N 9/08 20060101AFI20250519BHJP(生化学;ビール;酒精;ぶどう酒;酢;微生物学;酵素学;突然変異または遺伝子工学)
要約【課題】臨床診断薬用途を始めとする生化学分野、分析化学分野への利用に適した、ヘムタンパク質を安定化する方法を提供する。
【解決手段】ヘムタンパク質を安定化する方法であり、安定化作用のあるタンパク質を用いずに、-SO₃H基を持つ緩衝剤を選択することを特徴とする。
【選択図】なし
特許請求の範囲【請求項１】
－ＳＯ
３
Ｈ基を持つ緩衝剤を用いることを特徴とするヘムタンパク質の安定化方法。
続きを表示（約 1,200 文字）【請求項２】
前記、ヘムタンパク質はカタラーゼまたはペルオキシダーゼである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記、－ＳＯ
３
Ｈ基を有する緩衝剤が、２－〔４－（２－ヒドロキシエチル）－１－ピペラジニル〕エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、３－モルホリノプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）、Ｎ－トリス（ヒドロキシメチル）メチル－２－アミノメタンスルホン酸（ＴＥＳ）、Ｎ－（２－アセトアミド）－２－アミノエタンスルホン酸（ＡＣＥＳ）、Ｎ，Ｎ－ビス（２－ヒドロキシエチル）－２－アミノエタンスルホン酸（ＢＥＳ）、Ｎ－シクロヘキシル－３－アミノプロパンスルホン酸（ＣＡＰＳ）、Ｎ，Ｎ－ビス（２－ヒドロキシエチル）－２－アミノエタンスルホン酸（ＢＥＳ）、Ｎ－シクロヘキシル－２－アミノエタンスルホン酸（ＣＨＥＳ）、３－〔４－（２－ヒドロキシエチル）－１－ピペラジニル〕プロパンスルホン酸（ＥＰＰＳ）、２－ヒドロキシ－３－〔４－（２－ヒドロキシエチル）－１－ピペラジニル〕プロパンスルホン酸（ＨＥＰＰＳＯ）、２－モルホリノエタンスルホン酸（ＭＥＳ）、２－ヒドロキシ－３－モルホリノプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳＯ）、ピペラジン－１，４－ビス（２－エタンスルホン酸）（ＰＩＰＥＳ）、ピペラジン－１，４－ビス（２－ヒドロキシ－３－プロパンスルホン酸）（ＰＯＰＳＯ）、Ｎ－トリス（ヒドロキシメチル）メチル－３－アミノプロパンスルホン酸（ＴＡＰＳ）およびＮ－トリス（ヒドロキシメチル）メチル－３－アミノプロパンスルホン酸（ＴＡＰＳＯ）からなる群より選択される少なくとも１つの溶液である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記、緩衝剤の濃度が１ｍｍｏｌ／Ｌ～１０００ｍｍｏｌ／Ｌである、請求項１または２に記載の方法。
【請求項５】
カタラーゼの活性を安定化する作用の有する緩衝剤が、ＭＯＰＳ、ＴＥＳおよびＨＥＰＥＳからなる群より選択される少なくとも１種である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
ペルオキシダーゼの活性を安定化する作用の有する緩衝剤が、ＭＯＰＳおよびＴＥＳからなる群より選択される少なくとも１種である、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
―ＳＯ
３
Ｈ基を持つ緩衝剤とヘムタンパク質を共存させることを特徴とする、下記（ａ）から（ｄ）を少なくとも構成要素として含有する生体成分測定用試薬キット。
（ａ）カタラーゼ
（ｂ）ペルオキシダーゼ
（ｃ）ペルオキシダーゼの存在下で過酸化水素と反応して呈色する酸化還元発色試薬
（ｄ）－ＳＯ
３
Ｈ基を持つ緩衝剤
【請求項８】
生体成分が、クレアチニン、トリグリセリド、無機リン、クレアチン、コレステロールエステル、シアル酸、α－アミラーゼ、ＧＯＴ、ＧＰＴ、グアアーゼ、及びリン脂質からなる群より選択される少なくとも１種である、請求項７に記載の方法。

発明の詳細な説明【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヘムタンパク質の安定化方法に関する。より具体的には、特定の緩衝剤を用いて、ヘムタンパク質であるカタラーゼおよびペルオキシダーゼを安定化する方法に関する。
続きを表示（約 2,900 文字）【背景技術】
【０００２】
従来、臨床診断においては、酵素法による生体成分の測定が行われており、特に酸化酵素―ペルオキシダーゼ―酸化還元発色試薬系による方法、すなわち検体中の測定対象物質を酵素反応させて過酸化水素を発生させ、これをペルオキシダーゼの存在下、発色剤と反応させて比色定量する方法が広く行われている。この方法に用いられる酵素を含む組成物を長期間使用可能な状態にするためには、言うまでもなく酵素活性を安定的に保持することが重要である。
【０００３】
特許文献１には、タンパク質を含む有機溶剤含有溶液にタンパク質折り畳み因子を添加することによって、有機溶剤による不活性化を抑制する方法が記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
特開平１１－０９２４９５
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
特許文献１は、有機溶剤によるタンパク質の不活性化を抑制する方法を見出したものであり、限定的な条件下における安定化方法に限られる。一方、カタラーゼやペルオキシダーゼといったヘムタンパク質は、水溶液中で分解や変性を受けやすく、長期間の保管により、失活するという課題を本発明者は見出した。
本発明は、カタラーゼ等のヘムタンパク質の水溶液中での安定性を向上させる方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者は、上記課題を解決するために、鋭意検討した結果、－ＳＯ
３
Ｈ基を有する緩衝剤を用いることにより、ヘムタンパク質を安定化することを見出し、本発明を完成させるに至った。
すなわち、本発明は、以下のような構成からなる。
（項１）
－ＳＯ
３
Ｈ基を持つ緩衝剤を用いることを特徴とするヘムタンパク質の安定化方法。
（項２）
前記、ヘムタンパク質はカタラーゼまたはペルオキシダーゼである、項１に記載の方法。
（項３）
前記、－ＳＯ
３
Ｈ基を有する緩衝剤が、２－〔４－（２－ヒドロキシエチル）－１－ピペラジニル〕エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、３－モルホリノプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）、Ｎ－トリス（ヒドロキシメチル）メチル－２－アミノメタンスルホン酸（ＴＥＳ）、Ｎ－（２－アセトアミド）－２－アミノエタンスルホン酸（ＡＣＥＳ）、Ｎ，Ｎ－ビス（２－ヒドロキシエチル）－２－アミノエタンスルホン酸（ＢＥＳ）、Ｎ－シクロヘキシル－３－アミノプロパンスルホン酸（ＣＡＰＳ）、Ｎ，Ｎ－ビス（２－ヒドロキシエチル）－２－アミノエタンスルホン酸（ＢＥＳ）、Ｎ－シクロヘキシル－２－アミノエタンスルホン酸（ＣＨＥＳ）、３－〔４－（２－ヒドロキシエチル）－１－ピペラジニル〕プロパンスルホン酸（ＥＰＰＳ）、２－ヒドロキシ－３－〔４－（２－ヒドロキシエチル）－１－ピペラジニル〕プロパンスルホン酸（ＨＥＰＰＳＯ）、２－モルホリノエタンスルホン酸（ＭＥＳ）、２－ヒドロキシ－３－モルホリノプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳＯ）、ピペラジン－１，４－ビス（２－エタンスルホン酸）（ＰＩＰＥＳ）、ピペラジン－１，４－ビス（２－ヒドロキシ－３－プロパンスルホン酸）（ＰＯＰＳＯ）、Ｎ－トリス（ヒドロキシメチル）メチル－３－アミノプロパンスルホン酸（ＴＡＰＳ）およびＮ－トリス（ヒドロキシメチル）メチル－３－アミノプロパンスルホン酸（ＴＡＰＳＯ）からなる群より選択される少なくとも１つの溶液である、項１または２に記載の方法。
（項４）
前記、緩衝剤の濃度が１ｍｍｏｌ／Ｌ～１０００ｍｍｏｌ／Ｌである、項１～３のいずれかに記載の方法。
（項５）
カタラーゼの活性を安定化する作用の有する緩衝剤が、ＭＯＰＳ、ＴＥＳおよびＨＥＰＥＳからなる群より選択される少なくとも１種である、項１～４のいずれかに記載の方法。
（項６）
ペルオキシダーゼの活性を安定化する作用の有する緩衝剤が、ＭＯＰＳおよびＴＥＳからなる群より選択される少なくとも１種である、項１～５のいずれかに記載の方法。
（項７）
―ＳＯ
３
Ｈ基を持つ緩衝剤とヘムタンパク質を共存させることを特徴とする、下記（ａ）から（ｄ）を少なくとも構成要素として含有する生体成分測定用試薬キット。
（ａ）カタラーゼ
（ｂ）ペルオキシダーゼ
（ｃ）ペルオキシダーゼの存在下で過酸化水素と反応して呈色する酸化還元発色試薬
（ｄ）－ＳＯ
３
Ｈ基を持つ緩衝剤
（項８）
生体成分が、クレアチニン、トリグリセリド、無機リン、クレアチン、コレステロールエステル、シアル酸、α－アミラーゼ、ＧＯＴ、ＧＰＴ、グアアーゼ、及びリン脂質からなる群より選択される少なくとも１種である、項７に記載の方法。
【発明の効果】
【０００７】
本発明により、特定の緩衝剤を用いることで、ヘムタンパク質を安定化する方法を提供することが出来る。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
以下、本発明の実施形態を示しつつ、本発明についてさらに詳説するが、本発明はこれらに限定されるものではない。なお、本明細書中に記載された非特許文献および特許文献の全てが、本明細書中において参考として援用される。また本明細書中の「～」は「以上、以下」を意味し、例えば明細書中で「Ｘ～Ｙ」と記載されていれば「Ｘ以上、Ｙ以下」を示す。また本明細書中の「及び／又は」は、いずれか一方または両方を意味する。また本明細書において、単数形の表現は、他に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。
【０００９】
また、本発明の安定化の対象となる酵素は、その使用目的や濃度、存在形態などは特に限定されない。例えば、酵素を構成成分とし、酵素の機能を利用した組成物中に存在するものであれば、分子生物学用途の分析用試薬、生化学用途の分析試薬、体外診断薬、液状体外診断薬、チップ状またはスリット状に加工したドライ系の体外診断薬、酵素センサーや酵素電極、医薬品などの組成物が例示できる。これらの組成物は、既にそれぞれの産業分野において製造技術、利用技術が確立されている。よって、その知見を本発明に適用して、各種組成物中に存在する酵素を安定化することができ、その態様は特に制限されない。
【００１０】
（緩衝剤によるヘムタンパク質の安定化方法）
本発明の方法は、－ＳＯ
３
Ｈ基を有する緩衝剤を用いることでヘムタンパク質を安定化することである。
（【００１１】以降は省略されています）

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