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公開番号2024118708
公報種別公開特許公報(A)
公開日2024-09-02
出願番号2023025140
出願日2023-02-21
発明の名称リパーゼ変異体
出願人花王株式会社
代理人弁理士法人アルガ特許事務所
主分類C12N 15/55 20060101AFI20240826BHJP(生化学;ビール;酒精;ぶどう酒;酢;微生物学;酵素学;突然変異または遺伝子工学)
要約【課題】界面活性剤存在下の分散基質に対する活性阻害が改善されたリパーゼ変異体の提供。
【解決手段】一態様として、特定のアミノ酸配列と少なくとも75%の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ特定のアミノ酸残基に置換を有する、リパーゼ変異体であって、親リパーゼと比して、界面活性剤存在下の分散基質に対するリパーゼ活性阻害が改善され、界面活性剤存在下の硬質表面上トリグリセリドの除去能が向上しており、洗浄力に優れる、リパーゼ変異体。
【選択図】なし
特許請求の範囲【請求項１】
配列番号２、４、６又は８のアミノ酸配列と少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ下記（ａ）～（ｅ）からなる群より選択される１以上のアミノ酸残基を有する、リパーゼ変異体：
（ａ）配列番号２の番号付けで１２０位に相当する位置におけるロイシン以外のアミノ酸残基；
（ｂ）配列番号２の番号付けで１３０位に相当する位置におけるセリン以外のアミノ酸残基；
（ｃ）配列番号２の番号付けで１３４位に相当する位置におけるアラニン以外のアミノ酸残基；
（ｄ）配列番号２の番号付けで１３６位に相当する位置におけるロイシン以外のアミノ酸残基；及び
（ｅ）配列番号２の番号付けで１３７位に相当する位置におけるセリン以外のアミノ酸残基、
（但し、上記（ａ）～（ｅ）のうち（ｄ）のアミノ酸残基のみを有し、かつ前記アミノ酸残基がメチオニンの場合、前記リパーゼ変異体は配列番号２、４又は６のアミノ酸配列と少なくとも９３％の同一性を有するアミノ酸配列からなる）。
続きを表示（約 1,000 文字）【請求項２】
前記（ａ）～（ｅ）がそれぞれ下記（ａ’）～（ｅ’）である、請求項１に記載のリパーゼ変異体：
（ａ’）配列番号２の番号付けで１２０位に相当する位置におけるアラニン、フェニルアラニン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、リシン、メチオニン、アスパラギン、グルタミン、アルギニン、セリン、スレオニン、バリン、トリプトファン又はチロシン；
（ｂ’）配列番号２の番号付けで１３０位に相当する位置におけるアラニン、システイン、グルタミン酸、フェニルアラニン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、リシン、ロイシン、メチオニン、グルタミン、アルギニン、スレオニン、バリン、トリプトファン又はチロシン；
（ｃ’）配列番号２の番号付けで１３４位に相当する位置におけるシステイン、アスパラギン酸、グルタミン酸、グリシン、イソロイシン、スレオニン又はバリン；
（ｄ’）配列番号２の番号付けで１３６位に相当する位置におけるアラニン、システイン、グルタミン酸、フェニルアラニン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、メチオニン、セリン、スレオニン、バリン又はトリプトファン；及び
（ｅ’）配列番号２の番号付けで１３７位に相当する位置におけるシステイン、アスパラギン又はスレオニン、
（但し、上記（ａ’）～（ｅ’）のうち（ｄ’）のメチオニンのみを有する場合、前記リパーゼ変異体は配列番号２、４又は６のアミノ酸配列と少なくとも９３％の同一性を有するアミノ酸配列からなる）。
【請求項３】
前記（ａ’）～（ｅ’）からなる群より選択される２以上のアミノ酸残基を有する、請求項２に記載のリパーゼ変異体。
【請求項４】
請求項１～３のいずれか１項に記載のリパーゼ変異体をコードするポリヌクレオチド。
【請求項５】
請求項４に記載のポリヌクレオチドを含むベクター又はＤＮＡ断片。
【請求項６】
請求項５に記載のベクター又はＤＮＡ断片を含有する形質転換細胞。
【請求項７】
微生物である、請求項６に記載の形質転換細胞。
【請求項８】
請求項１～３のいずれか１項に記載のリパーゼ変異体を含有する洗浄剤組成物。
【請求項９】
衣料洗浄剤又は食器洗浄剤である、請求項８に記載の洗浄剤組成物。
【請求項１０】
請求項８又は９に記載の洗浄剤組成物を用いる、汚れの洗浄方法。
（【請求項１１】以降は省略されています）
発明の詳細な説明【技術分野】
【０００１】
本発明は、リパーゼ変異体に関する。
続きを表示（約 3,300 文字）【背景技術】
【０００２】
リパーゼは、洗濯洗剤、食器用洗剤、油脂加工、パルプ処理、飼料、医薬中間体合成など様々な用途において有用である。洗浄においては、リパーゼは脂質中のエステル結合を加水分解して脂肪酸を生成することによって油を含む汚れの除去に寄与する。
【０００３】
洗浄に有用なリパーゼとして、Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓｌａｎｕｇｉｎｏｓｕｓ由来のリパーゼ（以下ＴＬＬ）がＬＩＰＯＬＡＳＥ（登録商標）の商品名で販売されている。特許文献１にはＣｅｄｅｃｅａｓｐ－１６６４０株由来のリパーゼＬｉｐｒ１３９がＴＬＬと比較して優れた洗浄性能を有することが開示されている。特許文献２にはメタゲノム由来のリパーゼＬｉｐｒ１３８がＴＬＬと比較して優れた洗浄性能を有することが開示されている。
【０００４】
リパーゼの洗浄性能を十分に発揮させる手法として、特許文献３には、例えば、リパーゼと界面活性剤としてスルホコハク酸エステルを含む洗浄剤を油汚れが付着した硬質物品と接触させ、外力を加えずに放置することで油汚れを洗浄する方法が記載されている。界面活性剤を含まない水溶液中ではリパーゼによる硬質表面上トリグリセリドの除去はほとんど進行しないが、スルホコハク酸エステルを含む洗浄液中では、リパーゼによる硬質表面上トリグリセリドの除去が大幅に促進される。一方で、界面活性剤の非存在下においても、リパーゼは水溶液中に分散したエステル基質は効率的に分解することができる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
特表２０１５－５２３０７８号公報
特表２０１５－５２５２４８号公報
特開２０２１－１７５０８号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明者らは、スルホコハク酸エステルを含む洗浄液（以下、洗浄液）が、リパーゼによる硬質表面からのトリグリセリドの除去を大幅に促進するにもかかわらず（上記特許文献３）、洗浄液中に分散したエステル基質（以下、分散基質）に対するリパーゼ活性を大きく阻害するという予想外の現象を見出した。洗浄に好適であることが知られているＬｉｐｒ１３９及びＬｉｐｒ１３８は、スルホコハク酸エステルの存在下で分散基質に対する分解活性が５％以下に阻害され、ほとんど活性を検出することができなかった。よって、界面活性剤存在下の分散基質に対するリパーゼ活性阻害が緩和され、高い洗浄力を示すリパーゼが望まれる。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、親リパーゼと比して、界面活性剤存在下の分散基質に対するリパーゼ活性阻害が改善されたリパーゼ変異体を取得した。これらのリパーゼ変異体は、界面活性剤存在下の硬質表面上トリグリセリドの除去能も大きく向上していた。本発明者らは、また、リパーゼの界面活性剤存在下の分散基質に対するリパーゼ活性阻害の改善の程度とスルホコハク酸エステルの存在下の硬質表面上トリグリセリドの除去能の向上が強く相関すること、よって、界面活性剤存在下の分散基質に対するリパーゼ活性阻害の程度を指標として、スルホコハク酸エステルの存在下で硬質表面に付着した油汚れの分解能を有するリパーゼを評価又は選択できることを見出した。
【０００８】
すなわち、本発明は、下記１）～８）に係るものである。
１）配列番号２、４、６又は８のアミノ酸配列と少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ下記（ａ）～（ｅ）からなる群より選択される１以上のアミノ酸残基を有する、リパーゼ変異体：
（ａ）配列番号２の番号付けで１２０位に相当する位置におけるロイシン以外のアミノ酸残基；
（ｂ）配列番号２の番号付けで１３０位に相当する位置におけるセリン以外のアミノ酸残基；
（ｃ）配列番号２の番号付けで１３４位に相当する位置におけるアラニン以外のアミノ酸残基；
（ｄ）配列番号２の番号付けで１３６位に相当する位置におけるロイシン以外のアミノ酸残基；及び
（ｅ）配列番号２の番号付けで１３７位に相当する位置におけるセリン以外のアミノ酸残基、
（但し、上記（ａ）～（ｅ）のうち（ｄ）のアミノ酸残基のみを有し、かつ前記アミノ酸残基がメチオニンの場合、前記リパーゼ変異体は配列番号２、４又は６のアミノ酸配列と少なくとも９３％の同一性を有するアミノ酸配列からなる）。
２）１）に記載のリパーゼ変異体をコードするポリヌクレオチド。
３）２）に記載のポリヌクレオチドを含むベクター又はＤＮＡ断片。
４）３）に記載のベクター又はＤＮＡ断片を含有する形質転換細胞。
５）１）に記載のリパーゼ変異体を含有する洗浄剤組成物。
６）５）に記載の洗浄剤組成物を用いる、汚れの洗浄方法。
７）配列番号２、４、６又は８のアミノ酸配列と少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、下記（ｉ）～（ｖ）からなる群より選択される１以上の工程を行うことを含む、リパーゼ変異体の製造方法：
（ｉ）配列番号２の番号付けで１２０位に相当する位置のアミノ酸残基をロイシン以外のアミノ酸残基に置換する工程；
（ｉｉ）配列番号２の番号付けで１３０位に相当する位置のアミノ酸残基をセリン以外のアミノ酸残基に置換する工程；
（ｉｉｉ）配列番号２の番号付けで１３４位に相当する位置のアミノ酸残基をアラニン以外のアミノ酸残基に置換する工程；
（ｉｖ）配列番号２の番号付けで１３６位に相当する位置のアミノ酸残基をロイシン以外のアミノ酸残基に置換する工程；及び
（ｖ）配列番号２の番号付けで１３７位に相当する位置のアミノ酸残基をセリン以外のアミノ酸残基に置換する工程、
（但し、上記（ｉ）～（ｖ）のうち（ｉｖ）の工程のみを行うことを含み、かつメチオニンに置換する場合、前記ポリペプチドは配列番号２、４又は６のアミノ酸配列と少なくとも９３％の同一性を有するアミノ酸配列からなる）。
８）スルホコハク酸エステル又はその塩の存在下で硬質表面に付着した油汚れの分解能を有するリパーゼの評価又は選択方法であって、
被験リパーゼの界面活性剤存在下の分散基質に対するリパーゼ活性を測定する工程、
測定した結果に基づいて、被験リパーゼの界面活性剤によるリパーゼ活性阻害の程度を評価する工程、及び
界面活性剤によるリパーゼ活性阻害の程度が標準リパーゼより小さい被験リパーゼをスルホコハク酸エステル又はその塩の存在下で硬質表面に付着した油汚れの分解能を有するリパーゼとして評価又は選択する工程、
を含む方法。
【発明の効果】
【０００９】
本発明のリパーゼ変異体は、親リパーゼと比して、界面活性剤存在下の分散基質に対するリパーゼ活性阻害が改善され、界面活性剤存在下の硬質表面上トリグリセリドの除去能が向上しており、洗浄力に優れる。本発明のリパーゼの評価又は選択方法によれば、スルホコハク酸エステル又はその塩の存在下で硬質表面上の油汚れに対し高い洗浄力を示すリパーゼを簡便に感度よく評価又は選択することが可能である。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
各リパーゼのモデル洗浄液中での洗浄力の酵素効果。
各リパーゼのモデル洗浄液中での洗浄力の酵素効果。
各リパーゼのモデル洗浄液中での洗浄力の酵素効果とリパーゼ活性阻害の改善度の相関。
各リパーゼのモデル洗浄液中での洗浄力。
各リパーゼのモデル洗浄液中での洗浄力の酵素効果。
【発明を実施するための形態】
（【００１１】以降は省略されています）

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