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公開番号2025016632
公報種別公開特許公報(A)
公開日2025-02-04
出願番号2024191089,2021548555
出願日2024-10-30,2019-10-30
発明の名称GRAMC:シス調節モジュールのゲノムスケールレポーターアッセイ法
出願人ラトガーズ、ザステイトユニバーシティオブニュージャージー
代理人個人,個人,個人,個人,個人
主分類C12Q 1/6806 20180101AFI20250128BHJP(生化学;ビール;酒精;ぶどう酒;酢;微生物学;酵素学;突然変異または遺伝子工学)
要約【課題】GRAMC:シス調節モジュールのゲノムスケールレポーターアッセイ法の提供。
【解決手段】本明細書には、機能的調節エレメントのレポーター核酸のライブラリー、ならびにそのようなライブラリーを構築および使用するための方法およびキットが開示されている。例示的なライブラリー、方法、およびキットは、機能的核酸調節エレメントのハイスループット検出、同定、および/または定量化のために使用することができる。一部の例では、核酸は、目的の細胞または目的の細胞の集団から得られるゲノムDNAである。ゲノムDNAは、これらに限定されないが、動物(例えば、哺乳動物)、植物、細菌、真菌、または古細菌を含む、任意の目的の生物に由来してもよい。
【選択図】なし
特許請求の範囲【請求項１】
明細書に記載の発明。

発明の詳細な説明【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、２０１８年１０月３１日に出願された米国仮出願第６２／７５３，６０８号の利益を主張する。
続きを表示（約 4,000 文字）【０００２】
分野
本出願は、レポーター核酸、例えば機能的調節エレメントのライブラリー、ならびにそのようなライブラリーを構築および使用するための方法およびキットを提供する。
【背景技術】
【０００３】
エンハンサー、プロモーター、およびリプレッサーなどのシス調節モジュール（ＣＲＭ）は、ゲノムの機能的エレメントである。ヒトゲノムにわたって数十万個のＣＲＭが散在していると推定されている（Niu, et al. Nucleic acids research 46.11 (2018): 5395-5409; Visel, et al. Nature 461.7261 (2009):199；ENCODE Project Consortium. Nature 489.7414 (2012):57）。ＣＲＭは、遺伝子が、いつ、どこで、ど
のレベルで発現されるかを調節するため、ＣＲＭは、ほぼすべての生物学的プロセスに関与する。個々のＣＲＭが複数の転写因子と直接的に相互作用し、複数のＣＲＭが一緒になって機能して遺伝子調節活性を媒介する（Davidson. The Regulatory Genome, Elsevier (2006); Levine, et al. Cell 157.1 (2014): 13-25；De Laat, et al.
Nature 502.7472 (2013): 499）。こうしたエレメントの包括的な実験的同定は困難である。
【０００４】
ＣＲＭを同定するための標準的なレポーターアッセイは、基本プロモーターおよびレポーター遺伝子の上流にある候補ＣＲＭをクローニングし、レポーター遺伝子の発現を駆動するその能力を調査することである（Rosenthal, Methods in enzymology 152 (1987): 704-720；Arnone, et al. Methods in cell biology 74. (2004): 621-652；Banerji, et al. Cell 27.2 (1981): 299-308）。同じレポーター構築物により、ＣＲＭが、遺伝子摂動に対して（Nam, et al.PLoS One 7.4 (2012): e35934.）
、および転写結合部位の変異に対して（Damle, et al. Developmental biology 357.2 (2011): 505-517；de-Leon, et al. PNAS USA 107.22 (2010): 10103-10108；Cui, et al. Cell reports 19.2 (2017): 364-374；Emison, et al. Nature
434.7035 (2005): 857；Guerreiro, et al. PNAS USA 110.26 (2013): 10682-10686）、どのように応答するかをモニターすることができる。しかしながら、このような従来の１つずつのレポーターアッセイは、ゲノムに含有されている何百万個もの潜在的なＣＲＭの分析（例えば、ハイスループット分析）には好適ではない。幾つかのハイスループットアッセイが試みられているが、バイアスが問題となることがある。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
Ｒｏｓｅｎｔｈａｌ、Ｍｅｔｈｏｄｓｉｎｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（１９８７）１５２：７０４～７２０
Ａｒｎｏｎｅら、Ｍｅｔｈｏｄｓｉｎｃｅｌｌｂｉｏｌｏｇｙ（２００４）７４：６２１～６５２
Ｂａｎｅｒｊｉら、Ｃｅｌｌ（１９８１）２７．２：２９９～３０８
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本明細書には、核酸分子レポーターライブラリーを構築する方法、および本明細書に開示されている方法を使用して産生される核酸分子レポーターライブラリーが開示されている。本開示のゲノムスケールレポーターアッセイ法は、標準的なレポーターアッセイの場合と同様に、エンハンサーおよびプロモーターの両方に対して効果的である。本アッセイは、長鎖ＤＮＡインサートにも対応し、部分的なＣＲＭではなく完全なＣＲＭのスクリーニングを可能にする。ゲノムカバレッジおよびＤＮＡバーコードが過剰であると実験コストが増加し、ゲノムカバレッジおよびＤＮＡバーコードが不十分であると、信頼性の低いデータがもたらされる。しかしながら、本明細書で開示されているライブラリーおよび方法では、ゲノムカバレッジおよびライブラリー内のＤＮＡバーコードの数は調整可能である。最後に、本アッセイは、現在利用可能な方法と同等のまたはそれよりも少ない入力材料で、再現性のあるデータを生成する。
【０００７】
一部の実施形態では、核酸分子レポーターライブラリーを構築する方法は、選択されたサイズ範囲（例えば、約７５０～８５０塩基対長など、１００～３０００塩基対長のサイズ範囲）の複数の核酸分子（例えば、ゲノムＤＮＡまたは合成ＤＮＡ）を単離するステップ；複数の単離された核酸分子を、少なくとも１つの線状アダプター配列（３’末端の少なくとも１つのデオキシリボヌクレオチドおよび５’末端の少なくとも１つのデオキシリボヌクレオチドが隣接する少なくとも２つの連続したリボヌクレオチドを含むアダプターなど）にライゲートして、インサート（単離された核酸分子）およびアダプターを含む複数の環状核酸分子を形成するステップ；複数の環状核酸分子を、複数の線状核酸分子を産生するのに十分な条件下で酵素と接触させるステップ；ならびに複数の線状核酸分子を少なくとも１つのレポーター核酸と融合させて複数のレポーター構築物を産生し、核酸分子レポーターライブラリーを形成するステップを含む。
【０００８】
ゲノムＤＮＡ（ゲノムＤＮＡ断片など）または合成ＤＮＡを含む、任意の核酸分子を使用することができる。一部の例では、核酸は、目的の細胞または目的の細胞の集団から得られるゲノムＤＮＡである。ゲノムＤＮＡは、これらに限定されないが、動物（例えば、哺乳動物）、植物、細菌、真菌、または古細菌を含む、任意の目的の生物に由来してもよい。一部の例では、本方法は、ゲル電気泳動またはビーズに基づくサイズ選択を使用して、単離された核酸分子のサイズ範囲を選択するステップを含む。一部の例では、本方法は、複数の単離された核酸分子を、リガーゼを使用して少なくとも１つの線状アダプター配列にライゲートするステップを含む。一部の例では、リガーゼは、Ｔ４ＤＮＡリガーゼなどのＤＮＡリガーゼを含む。線状アダプター配列は、３’末端の少なくとも１つのデオキシリボヌクレオチドおよび５’末端の少なくとも１つのデオキシリボヌクレオチドが隣接する少なくとも２つの連続したリボヌクレオチド（例えば、配列番号１および／または配列番号２の核酸）を含んでいてもよい。したがって、ライゲーションにより、インサートおよびアダプターを含む複数の環状核酸分子が産生される。
【０００９】
一部の例では、本方法は、環状核酸を線状化する前に、複数の環状核酸分子を、複数の環状核酸分子から線状核酸分子を除去するのに十分な条件下で、エキソヌクレアーゼ（例えば、エキソヌクレアーゼＩ、エキソヌクレアーゼＩＩＩ、および／またはラムダエキソヌクレアーゼ）と接触させるステップをさらに含む。一部の例では、本方法は、次いで、複数の環状核酸分子を、インサートが隣接する、各々が３’末端の少なくとも１つのデオキシリボヌクレオチドおよび５’末端の少なくとも１つのデオキシリボヌクレオチドを含む複数の線状核酸分子を産生するのに十分な条件下で、エンドリボヌクレアーゼ（例えば、ＲＮａｓｅＨＩＩまたはウラシル－ＤＮＡグリコシラーゼなどの、ＤＮＡ二重鎖内のリボヌクレオチドに特異的なエンドリボヌクレアーゼ）と接触させるステップを含む。一部の例では、本方法は、複数の線状核酸分子を少なくとも１つのレポーター核酸（例えば、蛍光タンパク質をコードする核酸および／またはバーコードを含む核酸）と融合させて、複数のレポーター構築物を産生するステップを含む。
【００１０】
一部の例では、本方法は、複数の線状核酸分子のゲノムカバレッジを決定するステップをさらに含む。例えば、ゲノムカバレッジを決定するステップは、少なくとも１つの目的のゲノム領域を選択するステップ、複数の線状核酸分子を増幅するステップ、ならびに選択されたゲノム領域が複数の線状核酸分子に存在するか否か、複数の線状核酸分子における選択されたゲノム領域のコピー数、および／またはゲノムカバレッジを決定するステップを含んでいてもよい。一部の例では、ゲノムカバレッジは、分析のために１つまたは複数の単一コピー標的を選択することにより決定される。例示的な単一コピー標的としては、ＡＣＴＡ１、ＡＤＭ、ＡＤＡＭ１２、ＡＸＬ、ＣＦＢ、ＤＬＸ５、Ｋｉｓｓ１、ＮＣＯＡ６、Ｎｏｔｃｈ２、ＲＰＰ３０、およびＴＯＰ１が挙げられる。ライブラリーの出発材料の供給源に応じて、追加のまたは代替の単一コピー標的を選択することができる。
（【００１１】以降は省略されています）

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