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公開番号2025003190
公報種別公開特許公報(A)
公開日2025-01-09
出願番号2023103723
出願日2023-06-23
発明の名称miRNA検出方法
出願人株式会社GSP研究所
代理人個人
主分類C12Q 1/6841 20180101AFI20241226BHJP(生化学;ビール;酒精;ぶどう酒;酢;微生物学;酵素学;突然変異または遺伝子工学)
要約【課題】miRNAのin situ hybridization方法を提供する。
【解決手段】640nm以上の励起光を照射することにより蛍光を発する蛍光色素で標識したプローブを用いて、in situ hybridization法により、miRNAを検出する方法
【選択図】図2

特許請求の範囲【請求項１】
６４０ｎｍ以上の励起光を照射することにより蛍光を発する蛍光色素で標識したプローブを用いて、ｉｎｓｉｔｕｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ法により、ｍｉＲＮＡを検出する方法。
続きを表示（約 540 文字）【請求項２】
前記蛍光色素が、Ｃｙ５，Ｃｙ５．５，Ｃｙ７，Ｃｙ７．５，インドシアニングリーン，ｉＦＬＵＯＲ７９０，ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ７９０，ＩＲＤｙｅ８００からなる群から選ばれるいずれか１である、請求項１のｍｉＲＮＡを検出する方法。
【請求項３】
目的物の蛍光強度／バックグラウンドの蛍光強度が、１．５以上である蛍光物質を用いる、請求項１のｍｉＲＮＡのｉｎｓｉｔｕｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ方法。
【請求項４】
ホルマリン固定した組織標本を、
脱パラフィンする工程と、
脱水工程と
風乾する工程と、
Paraffin Pretreatment Solutionで、95～100℃で30分処理する工程と、
2XSSCで5分×2回洗浄する工程と、
脱水する工程と、
マイクロRNA FISH Probeを組織標本に滴下する工程と、
ハイブリダイゼーションする工程と、
洗浄する工程と、
DAPIを滴下する工程と、
蛍光顕微鏡で観察する工程と、
を有する、
請求項１のｍｉＲＮＡのｉｎｓｉｔｕｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ方法。

発明の詳細な説明【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＦＩＳＨ法に関する。より詳しくは、ｍｉＲＮＡの蛍光検出方法に関する。
続きを表示（約 1,800 文字）【背景技術】
【０００２】
ゲノムＤＮＡのＦＩＳＨ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔｉｎｓｉｔｕｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）法はターゲットが核ＤＮＡのためホルマリンで固定した組織標本でも核の周りの細胞質（タンパク質）を溶かし核ＤＮＡを裸の状態にすることができる。そのためホルマリンがタンパク質に架橋して強い自家蛍光を発することを防ぐことができ、更にFISHプローブを核内まで浸透しやすくして蛍光シグナルを得ることができる。
【０００３】
しかし、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）は細胞質に存在するため、ホルマリンで固定した細胞質を溶かすとｍｉＲＮＡも同時になくなってしまうため、ＦＩＳＨ法でシグナルを検出できないという問題があった。また、ＤＩＧでｍｉＲＮＡプローブを標識し、ハイブリダイズ後、ＤＩＧ抗体で検出する方法もあるが、煩雑であり、時間がかかるという問題があった。
【０００４】
そこで、ｍｉＲＮＡをより迅速かつ簡便に検出する方法が求められていた。また、バックグラウンド蛍光が邪魔をせず、ｍｉＲＮＡをＦＩＳＨで検出できる方法も求められていた
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
特開２００７－２４５１５０号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
ｍｉＲＮＡのｉｎｓｉｔｕｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
（１）６４０ｎｍ以上の励起光を照射することにより蛍光を発する蛍光色素で標識したプローブを用いて、ｉｎｓｉｔｕｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ法により、ｍｉＲＮＡを検出する方法。
（２）前記蛍光色素が、Ｃｙ５，Ｃｙ５．５，Ｃｙ７，Ｃｙ７．５，インドシアニングリーン，ｉＦＬＵＯＲ７９０，ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ７９０，ＩＲＤｙｅ８００からなる群から選ばれるいずれか１である、（１）のｍｉＲＮＡを検出する方法。
（３）目的物の蛍光強度／バックグラウンドの蛍光強度が、１．５以上である蛍光物質を用いる、（１）のｍｉＲＮＡのｉｎｓｉｔｕｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ方法。
（４）ホルマリン固定した組織標本を、
脱パラフィンする工程と、
脱水工程と
風乾する工程と、
Paraffin Pretreatment Solutionで、95～100℃で30分処理する工程と、
2XSSCで5分×2回洗浄する工程と、
脱水する工程と、
マイクロRNA FISH Probeを組織標本に滴下する工程と、
ハイブリダイゼーションする工程と、
洗浄する工程と、
DAPIを滴下する工程と、
蛍光顕微鏡で観察する工程と、
を有する、
（１）のｍｉＲＮＡのｉｎｓｉｔｕｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ方法。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、バックグラウンド蛍光が問題にならずに、ｍｉＲＮＡが検出できるという効果がある。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
図１は、バックグラウンドの蛍光を示す図である。
図２は、本発明の方法によるｍｉＲＮＡの検出を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本発明は、ｍｉＲＮＡをｉｎｓｉｔｕｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎにより検出する方法およびキットに関する。ホルマリンで固定した組織切片の核のＤＮＡを検出するｉｎｓｉｔｕｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ方法は確立されているが、同じ方法をｍｉＲＮＡの検出に適用することはできない。なぜなら、ＤＮＡは核内にあることから、細胞質を洗い流しても核は残り、ＤＮＡのｉｎｓｉｔｕｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎが可能である。これに対し、ｍｉＲＮＡは細胞質に存在するため、細胞質を洗い流しては、ｍｉＲＮＡを検出できない。また、細胞質には自家蛍光があるため、蛍光染色したプローブを励起して蛍光を観測することが難しい。蛍光プローブの発光が自家蛍光によりマスクされるためである。
（【００１１】以降は省略されています）

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