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公開番号2025043944
公報種別公開特許公報(A)
公開日2025-04-01
出願番号2023151559
出願日2023-09-19
発明の名称ウイルスからの核酸抽出法
出願人東洋紡株式会社
代理人
主分類C12Q 1/70 20060101AFI20250325BHJP(生化学;ビール;酒精;ぶどう酒;酢;微生物学;酵素学;突然変異または遺伝子工学)
要約【課題】熱処理工程を行うことなく、より簡便に試料中のウイルス由来の核酸を抽出、検出する方法およびキットを提供する。
【解決手段】本発明は、以下の工程:
(1)前記試料を、アルカリとキレート剤とを含む抽出剤に接触させ、核酸抽出液を生成させる工程、
(2)工程(1)で得られた核酸抽出液を核酸増幅用組成物と混合し、核酸増幅反応液を得る工程、
(3)工程(2)で得られた核酸増幅反応液を用いて核酸を増幅する工程、を含むことを特徴とする、ウイルスを含み得る試料から核酸を検出する方法を提供する。
【選択図】なし
特許請求の範囲【請求項１】
ウイルスを含み得る試料から核酸を検出する方法であって、
（１）前記試料を、アルカリとキレート剤とを含む抽出剤に接触させ、核酸抽出液を生成させる工程、
（２）工程（１）で得られた核酸抽出液を核酸増幅用組成物と混合し、核酸増幅反応液を得る工程、
（３）工程（２）で得られた核酸増幅反応液を用いて核酸を増幅する工程、を含むことを特徴とする方法。
続きを表示（約 640 文字）【請求項２】
前記核酸抽出液を前記核酸増幅用組成物と混合する前に熱処理を行わない、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記工程（１）が室温で実施される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記工程（１）が３０℃以下で実施される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記工程（３）が、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、等温核酸増幅法のいずれかの方法によって実施される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記工程（３）が、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって実施される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記試料が、糞便、胆汁、尿、咽頭ぬぐい液、鼻腔ぬぐい液、喀痰、肺吸引物、脳脊髄液、うがい液、唾液、涙液、血液、培養細胞、培養液、食品、河川水、雨水、海水、下水、風呂水、温泉水、プール水、土壌、及び環境から回収された試料からなる群より選択される少なくとも１種である請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記ウイルスが、エンベロープ性または非エンベロープ性のＲＮＡウイルスである請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記エンベロープ性のウイルスが、インフルエンザウイルスである請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記非エンベロープ性のウイルスが、ノロウイルスである請求項８に記載の方法。
（【請求項１１】以降は省略されています）
発明の詳細な説明【技術分野】
【０００１】
本発明は、ウイルスの検出のための核酸増幅の分野に関する。より具体的には試料の熱処理を行うことなく、試料に含まれ得るウイルスに由来する核酸を検出するための方法ならびにキットに関する。
続きを表示（約 3,900 文字）【背景技術】
【０００２】
核酸増幅法は数コピーの標的核酸を可視化可能なレベル、すなわち数億コピー以上に増幅する技術であり、生命科学研究分野のみならず、遺伝子診断、臨床検査といった医療分野、あるいは、食品や環境中の微生物検査等においても、広く用いられている。代表的な核酸増幅法は、ＰＣＲ（ＰｏｌｙｍｅｒａｓｅＣｈａｉｎＲｅａｃｔｉｏｎ）である。ＰＣＲは、（１）熱処理によるＤＮＡ変性（２本鎖ＤＮＡから１本鎖ＤＮＡへの解離）、（２）鋳型１本鎖ＤＮＡへのプライマーのアニーリング、（３）ＤＮＡポリメラーゼを用いた前記プライマーの伸長、という３ステップを１サイクルとし、このサイクルを繰り返すことによって、試料中の標的核酸を増幅する方法である。アニーリングと伸長を同温度で、２ステップで行う場合もある。
【０００３】
核酸増幅法としてＰＣＲの他、等温核酸増幅法が用いられることもある。等温核酸増幅法は、ＰＣＲと異なり、温度を上げ下げする必要がなく一定の温度で増幅する方法である。代表的な等温核酸増幅法として、ＬＡＭＰ（Ｌｏｏｐ－ｍｅｄｉａｔｅｄｉｓｏｔｈｅｒｍａｌａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、ＴＭＡ（ＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎＭｅｄｉａｔｅｄＡｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、ＮＥＡＲ（ＮｉｃｋｉｎｇＥｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅＡｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎＲｅａｃｔｉｏｎ）、ＳＤＡ（Ｓｔｒａｎｄｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、ＨＤＡ（Ｈｅｌｉｃａｓｅ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、ＮＡＳＢＡ（ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄＳｅｑｕｅｎｃｅｓＢａｓｅｄＡｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、ＳＰＩＡ（Ｓｉｎｇｌｅｐｒｉｍｅｒｉｓｏｔｈｅｒｍａｌａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）などが挙げられる。
【０００４】
核酸増幅法を利用した検査の対象となる試料は目的に応じて様々である。感染症原因菌の検出であれば、原因菌が存在しうる試料、すなわち、糞便、尿、血液、咽頭ぬぐい液、鼻腔ぬぐい液、喀痰、唾液をはじめとする生体由来試料などである。食品衛生検査であれば食品、あるいは食品取扱者から採取された糞便や尿など、環境衛生検査であれば土壌や河川水、雨水、海水、下水などの環境水、製造設備等の拭き取り試料などである。
【０００５】
試料から細菌を検出する場合、細菌から核酸を抽出したのち、核酸増幅を行う必要がある。細菌から核酸を抽出する方法として、さまざまな手法がある。
たとえば、特許文献１には、アルカリ熱抽出によって核酸を抽出する方法が記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
特許第５８８４１０８号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、特許文献１の方法に記載されるようなアルカリ処理だけでは核酸の抽出効率が十分でなく、別途試料を加熱処理する必要があり、時間がかかる。また、加熱処理工程をなくして時短を図るためにアルカリの濃度を高くすると、直接核酸増幅反応液に添加すると核酸増幅酵素が失活し、核酸増幅が阻害される要因となり、核酸抽出液を中和する工程が必要となるため、やはり時短を達成することができないという課題を本発明者等は見出した。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、上記の課題を解決するために鋭意研究を行った結果、核酸増幅を阻害しない濃度のアルカリと、キレート剤とを含む抽出剤を用いることで、事前の核酸精製や熱処理を行わずにウイルスより核酸を抽出できることを見出し本発明に到達した。
【０００９】
すなわち、代表的な本願発明は、以下の通りである。
［項１］
ウイルスを含み得る試料から核酸を検出する方法であって、
（１）前記試料を、アルカリとキレート剤とを含む抽出剤に接触させ、核酸抽出液を生成させる工程、
（２）工程（１）で得られた核酸抽出液を核酸増幅用組成物と混合し、核酸増幅反応液を得る工程、
（３）工程（２）で得られた核酸増幅反応液を用いて核酸を増幅する工程、を含むことを特徴とする方法。
［項２］
前記核酸抽出液を前記核酸増幅用組成物と混合する前に熱処理を行わない、項１に記載の方法。
［項３］
前記工程（１）が室温で実施される、項１または２に記載の方法。
［項４］
前記工程（１）が３０℃以下で実施される、項１～３のいずれか１つに記載の方法。
［項５］
前記工程（３）が、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、等温核酸増幅法のいずれかの方法によって実施される、項１～４のいずれか１つに記載の方法。
［項６］
前記工程（３）が、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって実施される、項５に記載の方法。
［項７］
前記試料が、糞便、胆汁、尿、咽頭ぬぐい液、鼻腔ぬぐい液、喀痰、肺吸引物、脳脊髄液、うがい液、唾液、涙液、血液、培養細胞、培養液、食品、河川水、雨水、海水、下水、風呂水、温泉水、プール水、土壌、及び環境から回収された試料からなる群より選択される少なくとも１種である項１～６のいずれか１つに記載の方法。
［項８］
前記ウイルスが、エンベロープ性または非エンベロープ性のＲＮＡウイルスである項１～７のいずれか１つに記載の方法。
［項９］
前記エンベロープ性のウイルスが、インフルエンザウイルスである項８に記載の方法。
［項１０］
前記非エンベロープ性のウイルスが、ノロウイルスである項８に記載の方法。
［項１１］
前記アルカリが、水酸化カリウム、水酸化ナトリウム、水酸化リチウム、水酸化マグネシウム、水酸化カルシウム、水酸化バリウム、炭酸カリウム、炭酸ナトリウム、炭酸マグネシウム及び炭酸カルシウムからなる群より選択される少なくとも１つ若しくは当該少なくとも１つのアルカリの溶液であるか、又は、トリス緩衝液、グリシン緩衝液、リン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、若しくはグッド緩衝液である、項１～１０のいずれか１つに記載の方法。
［項１２］
前記核酸抽出液中における前記アルカリの濃度が、０．０１Ｎ～２Ｎである、項１～１１のいずれか１つに記載の方法。
［項１３］
前記キレート剤がエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、シクロヘキサンジアミン四酢酸（ＣＤＴＡ）、グリコールエーテルジアミン四酢酸（ＥＧＴＡ）、ニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）、ヒドロキシエチルエチレンジアミン三酢酸（ＨＥＤＴＡ）、トリエチレンテトラアミン六酢酸（ＴＴＨＡ）、グルタミン酸二酢酸（ＧＬＤＡ）、ジヒドロキシエチルグリシン（ＤＨＥＧ）、ヒドロキシエタンジホスホン酸（ＨＥＤＰ）、メチレンホスホン酸（ＮＴＭＰ）、ホスホノブタントリカルボン酸（ＰＢＴＣ）、エチレンジアミンテトラメチレンホスホン酸（ＥＤＴＭＰ）、クエン酸、シュウ酸、フィチン酸、及びグルコン酸からなる群より選択される少なくとも１つである、項１～１２のいずれか１つに記載の方法。
［項１４］
前記核酸抽出液中における前記キレート剤の濃度が、０．５ｍＭ～１００ｍＭである、項１～１３のいずれか１つに記載の方法。
［項１５］
（a）アルカリ又はその溶液と、キレート剤又はその溶液とを含むか、または、
（b）アルカリおよびキレート剤またはそれらの溶液を含む、
熱処理を行うことなく、ウイルスを含み得る試料から核酸を抽出するための核酸抽出用キット。
［項１６］
請求項１に記載の方法に使用するためのウイルスの検出用キットであって、
（a）アルカリ又はその溶液と、キレート剤又はその溶液と、核酸増幅用組成物とを含むか、
（b）アルカリおよびキレート剤またはそれらの溶液と、核酸増幅用組成物とを含むキット。
［項１７］
前記工程（１）が室温で実施される、項１５または１６に記載のキット。
［項１８］
前記工程（１）が３０℃以下で実施される、項１５～１７のいずれか１つに記載のキット。
［項１９］
前記核酸増幅用組成物が耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを含む項１６～１８のいずれか１つに記載のキット。
［項２０］
前記核酸の検出領域に対応するハイブリダイゼーションプローブをさらに含むことを特徴とする項１６～１９のいずれか１つに記載のキット。
［項２１］
前記ウイルスが、エンベロープ性または非エンベロープ性のＲＮＡウイルスである項１５～２０のいずれか１つに記載のキット。
【発明の効果】
【００１０】
本発明の方法によれば、核酸増幅を阻害しない濃度のアルカリと、キレート剤とを含む抽出剤を用いることで、試料の熱処理を行わずに核酸を検出することができる。
【発明を実施するための形態】
（【００１１】以降は省略されています）

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