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公開番号2025124057
公報種別公開特許公報(A)
公開日2025-08-25
出願番号2025018485
出願日2025-02-06
発明の名称マイコバクテリウム属鑑別用オリゴヌクレオチド及びその用途
出願人東洋紡株式会社,国立大学法人筑波大学
代理人弁理士法人三枝国際特許事務所
主分類C12Q 1/6844 20180101AFI20250818BHJP(生化学;ビール;酒精;ぶどう酒;酢;微生物学;酵素学;突然変異または遺伝子工学)
要約【課題】マイコバクテリウム属抗酸菌種を検出する有用な方法を提供すること。
【解決手段】試料中に含まれ得るマイコバクテリウム属抗酸菌種を検出する方法であって、マイコバクテリウム属抗酸菌種のマルチコピー遺伝子に由来する複数の核酸領域を増幅することを含み、前記マルチコピー遺伝子が以下の特徴(a)及び/又は(b)を有する、方法が開示される:
(a)検出対象のマイコバクテリウム属抗酸菌種の各株間での配列同一性が82%以上であり、かつ検出対象のマイコバクテリウム属抗酸菌種と他のマイコバクテリウム属抗酸菌種との間の配列同一性が82%未満である;
(b)検出対象のマイコバクテリウム属抗酸菌種の98%超の株に存在する。
【選択図】なし
特許請求の範囲【請求項１】
試料中に含まれ得るマイコバクテリウム属抗酸菌種を検出する方法であって、マイコバクテリウム属抗酸菌種のマルチコピー遺伝子に由来する複数の核酸領域を増幅することを含み、前記マルチコピー遺伝子が以下の特徴（ａ）及び／又は（ｂ）を有する、方法：
（ａ）検出対象のマイコバクテリウム属抗酸菌種の各株間での配列同一性が８２％以上であり、かつ検出対象のマイコバクテリウム属抗酸菌種と他のマイコバクテリウム属抗酸菌種との間の配列同一性が８２％未満である；
（ｂ）検出対象のマイコバクテリウム属抗酸菌種の９８％超の株に存在する。
続きを表示（約 1,400 文字）【請求項２】
前記マルチコピー遺伝子が前記特徴（ａ）及び（ｂ）を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記複数の核酸領域がそれぞれ独立して５０～１５００塩基の長さを有する、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記複数の核酸領域の配列同一性が８５％以上である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記マルチコピー遺伝子がＨＮＨヌクレアーゼ遺伝子である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記複数の核酸領域の各々が配列番号１で示される塩基配列又はその相補的な塩基配列、配列番号３で示される塩基配列又はその相補的な塩基配列、配列番号５で示される塩基配列又はその相補的な塩基配列、配列番号７で示される塩基配列又はその相補的な塩基配列、及び配列番号９で示される塩基配列又はその相補的な塩基配列のいずれかに対して８５％以上の配列同一性を示す、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記複数の核酸領域の各々が配列番号２で示される塩基配列又はその相補的な塩基配列、配列番号４又はその相補的な塩基配列、配列番号６又はその相補的な塩基配列、配列番号８又はその相補的な塩基配列、及び配列番号１０又はその相補的な塩基配列のいずれかに対して８５％以上の配列同一性を示す、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記マイコバクテリウム属抗酸菌種が、マイコバクテリウム・ツベルクローシス、マイコバクテリウム・アビウム、マイコバクテリウム・イントラセルラーレ、マイコバクテリウム・アブセッサス、及びマイコバクテリウム・カンサシイのいずれか１以上である、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
以下の特徴（Ａ）～（Ｅ）のいずれか及び以下の特徴（Ｆ）を有する、マイコバクテリウム属抗酸菌検出用プローブ：
（Ａ）配列番号２の５０～９０の塩基配列若しくはその相補的な塩基配列において連続する少なくとも１０塩基の塩基配列Ａ１、又は塩基配列Ａ１において１～３個の塩基が置換、欠失、挿入若しくは付加した塩基配列Ａ２を有する；
（Ｂ）配列番号４の３０～７０番目の塩基配列若しくはその相補的な塩基配列において連続する少なくとも１０塩基の塩基配列Ｂ１、又は塩基配列Ｂ１において１～３個の塩基が置換、欠失、挿入若しくは付加した塩基配列Ｂ２を有する；
（Ｃ）配列番号６の４５～８５番目の塩基配列若しくはその相補的な塩基配列において連続する少なくとも１０塩基の塩基配列Ｃ１、又は塩基配列Ｃ１において１～３個の塩基が置換、欠失、挿入若しくは付加した塩基配列Ｃ２を有する；
（Ｄ）配列番号８の４５～８５番目の塩基配列若しくはその相補的な塩基配列において連続する少なくとも１０塩基の塩基配列Ｄ１、又は塩基配列Ｄ１において１～３個の塩基が置換、欠失、挿入若しくは付加した塩基配列Ｄ２を有する；
（Ｅ）配列番号１０の４５～８５番目の塩基配列若しくはその相補的な塩基配列において連続する少なくとも１０塩基の塩基配列Ｅ１、又は塩基配列Ｅ１において１～３個の塩基が置換、欠失、挿入若しくは付加した塩基配列Ｅ２を有する；
（Ｆ）５’末端又は３’末端のいずれか一方のみが標識されている。
【請求項１０】
前記（Ａ）～（Ｅ）の塩基配列の長さが１２～２０塩基である、請求項９に記載のプローブ。
（【請求項１１】以降は省略されています）
発明の詳細な説明【技術分野】
【０００１】
本発明は、試料中に含まれ得るマイコバクテリウム・ツベルクローシス(Mycobacterium tuberculosis, ＭＴＢ)、マイコバクテリウム・アビウム（Mycobacterium avium，ＭＡＶ）、マイコバクテリウム・イントラセルラーレ（Mycobacterium intracellulare，ＭＩＮ）、マイコバクテリウム・アブセッサス（Mycobacterium abscessus，ＭＡＢ）、及びマイコバクテリウム・カンサシイ（Mycobacterium kansasii，ＭＫＡ）に代表されるマイコバクテリウム属抗酸菌を検出（特に鑑別）するためのオリゴヌクレオチド等に関する。更に、本発明は、該オリゴヌクレオチドを用いて、試料中に含まれ得るマイコバクテリウム・ツベルクローシス(Mycobacterium tuberculosis, ＭＴＢ)、マイコバクテリウム・アビウム（Mycobacterium avium，ＭＡＶ）、マイコバクテリウム・イントラセルラーレ（Mycobacterium intracellulare，ＭＩＮ）、マイコバクテリウム・アブセッサス（Mycobacterium abscessus，ＭＡＢ）、マイコバクテリウム・カンサシイ（Mycobacterium kansasii，ＭＫＡ）に代表されるマイコバクテリウム属抗酸菌を検出（特に鑑別）する方法及びその方法に用いるための試薬及びキット等に関する。
続きを表示（約 1,800 文字）【背景技術】
【０００２】
マイコバクテリウム・ツベルクローシスは結核の原因病原体であり、病原性が高くヒト－ヒト感染を引き起こす。一方で、マイコバクテリウム・アビウム、マイコバクテリウム・イントラセルラーレ、マイコバクテリウム・アブセッサス、マイコバクテリウム・カンサシイを始めとする非結核性抗酸菌（non-tuberculosis mycobacteria, ＮＴＭ）は、病原性及び感染性が比較的に低いものの、ＮＴＭ症やＡＩＤＳなどの易感染患者に対する日和見感染を引き起こすことが知られている。結核とＮＴＭ症は臨床症状が似ているため、原因病原体であるマイコバクテリウム属抗酸菌を迅速かつ正確に鑑別判定することは、公衆衛生上、非常に重要である。
【０００３】
マイコバクテリウム属抗酸菌の検査方法としては古くから培養同定法が用いられてきた。しかしながら、一般的に増殖が遅く、菌種の同定までに約１ヶ月以上を要することが多い。そのため、近年では、核酸増幅法による迅速検査も行われている。核酸増幅法としてはＰＣＲ法やリアルタイムＰＣＲ法、ＴＲＣ法などが主に用いられている（特許文献１、特許文献２、特許文献３、特許文献４）。核酸増幅法のターゲットとなる核酸についてはリボソームＲＮＡ遺伝子やｒｐｏＢ遺伝子などが挙げられる。
【０００４】
マイコバクテリウム属抗酸菌は、各種間で遺伝子配列が非常に似通っていることが知られている。このため、従来の核酸増幅法のターゲットとされてきた遺伝子配列では、交差反応による偽陽性が多いことが課題となっている（非特許文献１、非特許文献２）。また、これらの遺伝子配列は抗酸菌ゲノムあたり１コピーしか存在しない。
【０００５】
配列同一性が高い特定の塩基配列がゲノム上に複数存在するマルチコピーと呼ばれる遺伝子配列をターゲットとする核酸増幅法も知られている。例えば、マイコバクテリウム・ツベルクローシスのIS6110遺伝子は、マルチコピー遺伝子であり、核酸増幅法のターゲットとして広く利用されている（非特許文献３）。一方で、非結核性抗酸菌にも、例えばマイコバクテリウム・アビウムのIS1245遺伝子のようなマルチコピー遺伝子が存在する。しかしながら、亜種の一部を検出できなかったり、種特異的な検出ができなかったりする（非特許文献４）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
ＷＯ２０２１／１２４９６０
特許第６２２１５６３号公報
特許第６３８７５９３号公報
特許第５２８６９９６号公報
【非特許文献】
【０００７】
近松絹代他、結核、２０１６、９１、６２３－６２９
藤森巧他、医学検査、２０２０、６９、１４５－１５１
Ｔｈｉｅｒｒｙ，Ｄ. ｅｔ．ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎｉｃａｌ．ＭｉｃｒｏＢｉｏｌ．，１９９０，２８，２６６８－２６７３
Ｉｃｈｉｋａｗａ，Ｋ．ｅｔ．ａｌ．，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，２００９，５８，９４５－９５０
Ｐａｒｋ，Ｊ．ｅｔ．ａｌ．，ＭｉｃｒｏｂｉｏｌＳｐｅｃｔｒ．，２０２３，１１，ｅ０１６０６２３
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、従来のターゲットとされてきた遺伝子配列とは全く異なる新規の遺伝子配列をターゲットとして、マイコバクテリウム属抗酸菌を検出（特に鑑別判定）できる有用な方法等を開発すべくなされたものである。
【０００９】
本発明は、マイコバクテリウム属抗酸菌を検出（特に鑑別判定）する有用な方法、なかでもマイコバクテリウム属抗酸菌のゲノム中に複数存在する新規の遺伝子配列をターゲットとしながら特異的かつ高感度かつ漏れなくマイコバクテリウム属抗酸菌を同時に検出する方法等を提供することを１つの目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、上記課題に鑑み鋭意検討した結果、特定の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドのいずれか一方の末端のみを標識したプローブを用いることによって、マイコバクテリウム属抗酸菌を検出（特に１反応中で同時に検出）可能であり、特に鑑別可能であることを見出した。斯かる知見を基に更に検討を重ねることにより、本発明を完成した。
（【００１１】以降は省略されています）

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