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公開番号2025029868
公報種別公開特許公報(A)
公開日2025-03-07
出願番号2023134740
出願日2023-08-22
発明の名称ASC欠損非ヒト哺乳動物
出願人国立大学法人愛媛大学
代理人個人,個人
主分類C12N 15/09 20060101AFI20250228BHJP(生化学;ビール;酒精;ぶどう酒;酢;微生物学;酵素学;突然変異または遺伝子工学)
要約【課題】Pycard遺伝子の非翻訳領域を有しつつ、ASCをコードする領域のみを欠損したマウスの提供。
【解決手段】以下のDNA:(i) Pycard遺伝子の非翻訳領域の塩基配列を含み、かつ(ii) ASCタンパク質をコードする塩基配列を含まない、DNAをゲノムに含む、遺伝子組換え非ヒト哺乳動物。
【選択図】なし
特許請求の範囲【請求項１】
以下のDNA：
(i) Pycard遺伝子の非翻訳領域の塩基配列を含み、かつ
(ii) ASCタンパク質をコードする塩基配列を含まない、DNA
をゲノムに含む、遺伝子組換え非ヒト哺乳動物。
続きを表示（約 950 文字）【請求項２】
前記Pycard遺伝子の非翻訳領域の塩基配列が、Pycard遺伝子の5'非翻訳領域及び3'非翻訳領域の塩基配列を含み、前記5'非翻訳領域の塩基配列が配列番号１の塩基配列を含み、前記3'非翻訳領域の塩基配列が配列番号２の塩基配列を含むものである、請求項１に記載の動物。
【請求項３】
前記DNAが、Pycard遺伝子の5'非翻訳領域の塩基配列、開始コドン、終止コドン及び3'非翻訳領域の塩基配列をこの順に含み、前記開始コドンと前記終止コドンとの間にASCタンパク質をコードする塩基配列を含まないものである、請求項１に記載の動物。
【請求項４】
前記DNAが、配列番号１の塩基配列及び配列番号２の塩基配列を含み、かつ配列番号３の塩基配列と少なくとも90%以上の配列同一性を有するものである、請求項１に記載の動物。
【請求項５】
前記DNAが配列番号３の塩基配列を含むものである、請求項１に記載の動物。
【請求項６】
正常非ヒト哺乳動物と比較して、免疫反応の誘導による結腸の粘膜下浮腫が抑制される、請求項１に記載の動物。
【請求項７】
正常非ヒト哺乳動物と比較して、免疫反応の誘導による肺の炎症反応が抑制されない、請求項１に記載の動物。
【請求項８】
ASC欠損遺伝子組換え非ヒト哺乳動物の製造方法であって、非ヒト哺乳動物のゲノムにおけるPycard遺伝子の非翻訳領域の塩基配列を維持しつつ、ASCタンパク質をコードする塩基配列を欠損させる工程を含み、
前記遺伝子組換え非ヒト哺乳動物は、以下のDNA：
(i) Pycard遺伝子の非翻訳領域の塩基配列を含み、かつ
(ii) ASCタンパク質をコードする塩基配列を含まない、DNA
をゲノムに含むものである、
前記方法。
【請求項９】
前記ASCタンパク質をコードする塩基配列を欠損させる工程が、非ヒト哺乳動物のゲノムにおけるASCタンパク質をコードする塩基配列において、該塩基配列の開始コドンの直後に終止コドンを含むDNAを挿入することによるものである、請求項８に記載の方法。

発明の詳細な説明【技術分野】
【０００１】
本発明は、Pycard遺伝子の非翻訳領域を有しつつ、ASCをコードする領域のみを欠損した非ヒト哺乳動物に関する。
続きを表示（約 5,900 文字）【背景技術】
【０００２】
ASC（apoptosis-associated speck-like protein containing a caspase recruitment domain）は、インフラマソームの構成タンパク質の一つである。インフラマソームは、感染や傷害等に対する炎症反応の制御に関与する細胞内の複合体である。
ASCは、Pycard遺伝子の翻訳領域にコードされる。Pycard遺伝子全体（非翻訳領域を含む）をノックアウトすることでASCをノックアウトしたマウスは知られている（非特許文献１：Yamamoto M et al., Genes Cells. 2004; 9(11): 1055-67;非特許文献２：Mariathasan S,et al., Nature. 2004; 430(6996): 213-8.; 引用文献３ Ozoren N, et al., J Immunol.2006; 176(7): 4337-42）。
しかし、Pycard遺伝子の非翻訳領域を有しつつ、ASCをコードする領域のみを欠損したマウスは知られていない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
Yamamoto M et al., Genes Cells. 2004; 9(11): 1055-67
Mariathasan S,et al., Nature. 2004; 430(6996): 213-8.
Ozoren N, et al., J Immunol.2006; 176(7): 4337-42
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明はこのような状況に鑑みてなされたものであり、その解決しようとする課題は、Pycard遺伝子の非翻訳領域を有しつつ、ASCをコードする領域のみを欠損したマウスを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を行った結果、Pycard遺伝子の非翻訳領域の塩基配列を含み、かつASCタンパク質をコードする塩基配列を含まないDNAをゲノムに含む、遺伝子組換え非ヒト哺乳動物を作製することに成功し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は以下の通りである。
【０００６】
［１］
以下のDNA：
(i) Pycard遺伝子の非翻訳領域の塩基配列を含み、かつ
(ii) ASCタンパク質をコードする塩基配列を含まない、DNA
をゲノムに含む、遺伝子組換え非ヒト哺乳動物。
［２］
前記Pycard遺伝子の非翻訳領域の塩基配列が、Pycard遺伝子の5'非翻訳領域及び3'非翻訳領域の塩基配列を含み、前記5'非翻訳領域の塩基配列が配列番号１の塩基配列を含み、前記3'非翻訳領域の塩基配列が配列番号２の塩基配列を含むものである、上記［１］に記載の動物。
［３］
前記DNAが、Pycard遺伝子の5'非翻訳領域の塩基配列、開始コドン、終止コドン及び3'非翻訳領域の塩基配列をこの順に含み、前記開始コドンと前記終止コドンとの間にASCタンパク質をコードする塩基配列を含まないものである、上記［１］に記載の動物。
［４］
前記DNAが、配列番号１の塩基配列及び配列番号２の塩基配列を含み、かつ配列番号３の塩基配列と少なくとも90%以上の配列同一性を有するものである、上記［１］に記載の動物。
［５］
前記DNAが配列番号３の塩基配列を含むものである、上記［１］に記載の動物。
［６］
正常非ヒト哺乳動物と比較して、免疫反応の誘導による結腸の粘膜下浮腫が抑制される、上記［１］に記載の動物。
［７］
正常非ヒト哺乳動物と比較して、免疫反応の誘導による肺の炎症反応が抑制されない、上記［１］に記載の動物。
［８］
ASC欠損遺伝子組換え非ヒト哺乳動物の製造方法であって、非ヒト哺乳動物のゲノムにおけるPycard遺伝子の非翻訳領域の塩基配列を維持しつつ、ASCタンパク質をコードする塩基配列を欠損させる工程を含み、
前記遺伝子組換え非ヒト哺乳動物は、以下のDNA：
(i) Pycard遺伝子の非翻訳領域の塩基配列を含み、かつ
(ii) ASCタンパク質をコードする塩基配列を含まない、DNA
をゲノムに含むものである、
前記方法。
［９］
前記ASCタンパク質をコードする塩基配列を欠損させる工程が、非ヒト哺乳動物のゲノムにおけるASCタンパク質をコードする塩基配列において、該塩基配列の開始コドンの直後に終止コドンを含むDNAを挿入することによるものである、上記［８］に記載の方法。
【発明の効果】
【０００７】
本発明を用いることにより、Pycard遺伝子の非翻訳領域による機能を考慮する必要なく、ASCタンパク質のみの機能を解析することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
［図１Ａ］ADマウスにおける、asc／pycard遺伝子の遺伝子座、gRNA1とgRNA2のドナーDNA、及び変異した対立遺伝子の模式図である。PCRに用いるプライマーの位置も示す。
［図１Ｂ］～［図１Ｄ］Ｂ：ゲノム編集された配列を、従来技術であるSanger法を用いたDNA配列決定法により確認した結果を示す図である。Ｃ：特異的なプライマーセットを用いて変異特異的PCRを行った結果を示す図である。Ｄ：骨髄および脾臓溶解物におけるASC発現のウェスタンブロッティングの結果を示す図である。野生型ホモ接合体マウス(asc +/+)、ADホモ接合体マウス(asc -/-)及びヘテロ接合体マウス(asc +/-)について実施した。対照としてチューブリンを用いた。
WTマウス及びADマウスにおけるサイトカイン産生、並びにこれらのマウスの生存について検討した結果を示す図である。LPSの刺激後、ADマウスはWTマウスより長く生存し、IL‐1β分泌が抑制される。[Ａ及びＢ]：図に示された濃度のMDP又はLPSとともに骨髄細胞（2×10
5
）を8時間インキュベートした結果を示す。培養上清中のIL‐1β濃度（A）とTNF-α濃度（B）をELISAで測定した。結果は3回の培養の平均SDとして示す。データは3つの独立した実験結果を示す。[Ｃ～Ｅ] ：WT及びADマウスに、PBS中50μg／gのLPS(黒丸）又はPBS単独（白丸）で腹腔内注射した結果を示す図である。LPSによる刺激の4時間後に、血清IL－1β濃度（C）、血清TNF-α濃度（D）、血清IL－6濃度（E）をELISAで測定した。結果をプロットし、平均値を示す。*p値＜0．05を有意とした。[Ｆ]： 50μg／gのLPSを注射したWT (asc +/+)マウス(n = 8）及びAD (asc -/-)マウス(n = 7）に対するKaplan-Meier生存曲線データは、ログランク検定を用いて解析した(p= 0．0006）。
LPS刺激後のWTマウス組織の病理組織像を示す図である。各画像は5匹のマウスの代表例を示す。LPS刺激後0時間、4時間、12時間のWTマウスの胃、小腸、結腸、肺、心臓、肝臓、腎臓、脾臓、脳組織のHE染色画像を示す。アスタリスクは粘膜下浮腫を示す。毛細血管拡張は小さな矢印で示す。うっ血は大きな矢印で示す。好中球を矢頭で示す。図中のバー（黒線）は、それぞれ100μm (low power view）、25μm (medium power view）、および5μm (high power view）を示す。
LPS刺激後のADマウス組織の病理組織像を示す図である。各画像は5匹のマウスの代表例を示す。LPS刺激後0時間、4時間、12時間のADマウスの胃、小腸、結腸、肺、心臓、肝臓、腎臓、脾臓、脳組織のHE染色画像を示す。毛細血管拡張は小さな矢印で示す。うっ血は大きな矢印で示す。好中球は矢頭で示す。図中のバー（黒線）は、それぞれ100μm (low power view）、25μm (medium power view）、および5μm (high power view）を示す。
LPS刺激後のWTマウス及びADマウスにおける結腸粘膜下浮腫についての組織病理学的比較の結果を示す図である。各画像は各グループの代表例を示す。Ａ：LPS刺激前（0時間（0h）及びLPS刺激から12時間後（12h）の結腸のHE染色結果を示す。バー（黒線）＝100μm。Ｂ：結腸の粘膜（a）、粘膜下組織（b）、固有筋層（c）の厚さを測定するのに用いた方法の説明を示す。平均厚さはa
1
+a
2
+a
3
の平均であった。粘膜下層の平均厚さはb
1
+b
2
+b
3
の平均とした。固有筋層（muscularis propria）の平均厚さは、c
1
+c
2
+c
3
の平均とした。バー（黒線）＝100μm。Ｃ：粘膜下層の平均厚さを示す。Ｄ：粘膜／粘膜下層／固有筋層の全厚（a＋b＋c）に対する粘膜下層（b）の平均厚さを示す。Ｅ：粘膜の平均厚さを示す。Ｆ：固有筋層の平均厚さを示す。*p値＜0．05。**p値＜0．01。
［図６Ａ］及び［図６Ｂ］LPS刺激後のWTマウス及びADマウスにおける急性肺傷害についての組織病理学的比較の結果を示す図である。各画像は各群の代表例を示す。Ａ：LPS刺激前（0時間）及びLPS刺激から12時間後の肺のHE染色。内皮に付着した好中球を矢頭で示す。バー（黒線）＝100μm。Ｂ：間質毛細血管の内皮に付着する好中球の数及び平均毛細血管周囲径を測定するのに用いた方法を示す。黄色線でマークした毛細血管中の好中球の総数をカウントした。合計34本の毛細血管を計数し、各々の周囲径を測定した。毛細血管周囲径の単位あたりの好中球数を算出した。バー（黒線）＝100μm。
［図６Ｃ］～［図６Ｅ］LPS刺激後のWTマウス及びADマウスにおける急性肺傷害についての組織病理学的比較の結果を示す図である。Ｃ：間質毛細血管の内皮に付着する好中球の平均数を示す。Ｄ：平均毛細血管周囲径を示す。Ｅ：間質性毛細血管の内皮に付着する好中球の数対拡張した毛細血管の周囲径を示す。結果は、平均値±標準偏差で表す。*p値＜0．05。**p値＜0．01。
LPS刺激後のWTマウス及びADマウスの結腸におけるIL-1β、TNF-α及びIL-6の発現の免疫組織化学的比較を示す図である。結腸由来のホルマリン固定及びパラフィン包埋標本をヘマトキシリン及びエオシン(HE)で染色した。連続切片をIL-1β、TNF-α、IL-6に特異的な抗体で免疫染色した。陰性対照（一次抗体なし）も含む。IL-1β、TNF-α、IL-6の陽性染色をそれぞれ1本の矢印、2本の矢印、3本の矢印で示す。アスタリスクは粘膜下浮腫を示す。好中球は矢頭で示す。「0h」はLPS刺激前を示し、「12h」はLPS刺激から12時間後を示す。AD：ASC欠損、WT：野生型。バー（黒線）=100μm。
LPS刺激後のWTマウス及びADマウスの肺におけるIL-1β、TNF-α及びIL-6の発現の免疫組織化学的比較を示す図である。肺由来のホルマリン固定およびパラフィン包埋標本をヘマトキシリンおよびエオシン(HE)で染色した。連続切片をIL-1β、TNF-α及びIL-6に特異的な抗体で免疫染色した。陰性対照（一次抗体なし）も含む。IL-1β、TNF-α、IL-6の陽性染色を、それぞれ矢頭、黒矢印、赤矢印で示す。「0h」はLPS刺激前を示し、「12h」はLPS刺激から12時間後を示す。AD：ASC欠損、WT：野生型。バー（黒線）=100μm。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
以下、本発明を詳細に説明する。以下の実施の形態は、本発明を説明するための例示であり、本発明をこの実施の形態のみに限定する趣旨ではない。本発明は、その要旨を逸脱しない限り、様々な形態で実施をすることができる。
【００１０】
１．
概要
現在、ASCをノックアウトしたマウスは知られているが、これらのマウスはいずれも、Pycard遺伝子全体（非翻訳領域を含む）をノックアウトするものであり、このノックアウトによりPycard遺伝子における非翻訳領域RNAの機能が失われる。
したがって、これらのノックアウトマウスをASCの機能解析に用いた場合、ノックアウトされた機能が、本来はPycard遺伝子の非翻訳領域RNAによる機能であるにもかかわらず、ASCの機能であるとの誤認を生じる可能性がある。この場合、ASCのみの機能を正確に解析することは困難となる。
また、Pycard遺伝子の非翻訳領域RNAによる機能をASCによる機能であるとの誤認が生じたまま医薬開発を行った結果、ASCを標的とした医薬は、当該Pycard遺伝子の非翻訳領域RNAの機能に対する効果を奏しないために、目的の効果が得られない可能性もある。
本発明者は、このような状況を回避し、ASCのみの機能を正確に解析するために、Pycard遺伝子の非翻訳領域を含むが、ASCタンパク質をコードする塩基配列を含まない、遺伝子組換え非ヒト哺乳動物を作製した。
本発明の非ヒト哺乳動物を用いた解析を行うことにより、Pycard遺伝子の非翻訳領域による影響を考慮することなく、ASCのみについての正確な機能解析が可能となる。
したがって、本発明の非ヒト哺乳動物は、ASCに関する研究やASCを標的とした医薬品開発に極めて有用である。
（【００１１】以降は省略されています）

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