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公開番号2025016597
公報種別公開特許公報(A)
公開日2025-02-04
出願番号2024189308,2022525590
出願日2024-10-28,2020-01-17
発明の名称DNAメチル化バイオマーカーの組み合わせ、検出方法および試薬キット
出願人広州市基准医療有限公司,ANCHORDX MEDICAL CO., LTD.
代理人個人
主分類C12Q 1/6886 20180101AFI20250128BHJP(生化学;ビール;酒精;ぶどう酒;酢;微生物学;酵素学;突然変異または遺伝子工学)
要約【課題】DNAメチル化バイオマーカーの組み合わせ、検出方法および試薬キットを提供する。
【解決手段】ヒト被験者から得られた尿サンプルのDNAをバイサルファイト処理するステップと、特定の相補配列の少なくとも一つのCpG領域について、メチル化特異的定量PCRを実施してDNAを増幅し、CT値を得るステップと、前記得たCT値を、少なくとも一つのCpG領域の予め定められたCT値の範囲と比較し、被験者に膀胱癌の有無を判定するステップとを含んでなり、前記予め定められたCT値の範囲が、膀胱癌が存在するサンプルと膀胱癌が存在しないサンプルを含むトレーニングセットのサンプルの統計的解析から導出されたことを特徴とする膀胱癌リスクの判定方法を提供する。
【選択図】図3
特許請求の範囲【請求項１】
ヒト被験者から得られた尿サンプルのDNAをバイサルファイト処理するステップと、
配列番号３または配列番号３の相補配列の少なくとも一つのCpG領域について、メチル化特異的定量PCRを実施してDNAを増幅し、CT値を得るステップと、
前記得たCT値を、少なくとも一つのCpG領域の予め定められたCT値の範囲と比較し、被験者に膀胱癌の有無を判定するステップとを含んでなり、
前記予め定められたCT値の範囲が、膀胱癌が存在するサンプルと膀胱癌が存在しないサンプルを含むトレーニングセットのサンプルの統計的解析から導出されたことを特徴とする膀胱癌リスクの判定方法。
続きを表示（約 1,300 文字）【請求項２】
前記メチル化特異的定量PCRによりDNAを増幅しCT値を得るステップが、配列番号５の配列またはその相補配列の少なくとも第2のCpG領域のCT値を取得するステップであることと、
前記判定するステップが、前記サンプルの前記第2のCpG領域の取得したCT値を、前記第2のCpG領域の前もって決められたCT値の範囲と比較するステップであることとを特徴とする請求項１に記載の判定方法。
【請求項３】
前記メチル化特異的定量PCRによりDNAを増幅しCT値を得るステップが、配列番号７の配列またはその相補配列の少なくとも第３のCpG領域のCT値を取得するステップであることと、
前記判定するステップが、前記サンプルの前記第３のCpG領域の取得したCT値を、前記第３のCpG領域の前もって決められたCT値の範囲と比較するステップであることとを特徴とする請求項１に記載の判定方法。
【請求項４】
前記被験者に膀胱がんが存在するかを判定するステップが、さらに、その膀胱がんが低グレードか高グレードかを決定することを特徴とする請求項１に記載の判定方法。
【請求項５】
前記ヒト記被験者に膀胱がんが存在するかを判定するステップが、さらに、膀胱がんが非筋層浸潤性膀胱がんまたは筋層浸潤性膀胱がんであるかを決定することを特徴とする請求項１に記載の判定方法。
【請求項６】
ヒト被験者から得られた尿サンプルのDNAに対して、バイサルファイト処理を行うステップと、
配列番号3、5、7の配列またはこれらの配列の相補配列の少なくとも3つのCpG領域について、メチル化特異的定量PCRで前記DNAを増幅し、CT値を得るステップと、
前記少なくとも3つのCpG領域の得られたCT値を、膀胱癌が存在するサンプルと膀胱癌が存在しないサンプルを含むトレーニングセットの統計的解析により導出された前記少なくとも3つのCpG領域のCT値の予め定められた範囲と比較することにより、前記被験者に膀胱癌が存在するか否かを判定するステップと、を含むヒト被験者の膀胱癌リスクの判定方法。
【請求項７】
ヒト被験者から得られた尿サンプルのDNAに対して、バイサルファイト処理をするステップと、
配列番号３、５、７の配列またはこれら配列の相補配列の少なくとも３つのCpG領域について、メチル化特異的定量PCRで前記DNAを増幅し、CT値を求めるステップと、
得られたサンプルの少なくとも３つのCpG領域のCT値を、膀胱癌が存在するサンプルと存在しないサンプルを含むトレーニングセットの統計解析から得られた各々のCpG領域のあらかじめ設定されたCT値の範囲と比較し、被験者の膀胱癌のリスクレベルを、低・中等リスク非筋侵襲性膀胱癌(NMIBC)、高リスクNMIBC、筋侵襲性膀胱癌(MIBC)のいずれかに層別化するステップと含む、膀胱癌のリスク層別化方法。
【請求項８】
前記リスク層別化方法が、膀胱癌を低リスクから中等度リスクの膀胱癌、または高リスク膀胱癌のいずれかに分類することを特徴とする、請求項８に記載の方法。

発明の詳細な説明【技術分野】
【０００１】
本発明は、バイオテクノロジーの分野に属し、特に、DNAメチル化バイオマーカーの組み合わせと検出試薬キットおよび検出方法に関する。
続きを表示（約 1,600 文字）【背景技術】
【０００２】
膀胱がんは、泌尿器系で最も一般的な悪性腫瘍の１つで、2014年の中国での膀胱がんの発症数は7.8万人／年で、発症率は年々増加の傾向にある。膀胱がんは、発症率が高く、再発しやすいという特徴がある。血尿は、膀胱がんの一般的な臨床症状で、血尿患者の約17％に膀胱がんが検出されていた。現在、膀胱がんの主な診断方法として、膀胱鏡検査、尿中剥離細胞診、尿FISH検出および腫瘍マーカー検査が挙げられる。生体組織診断（生研）と組み合わせた膀胱鏡検査は、膀胱鏡診断のゴールドスタンダードであるが、この方法は、侵襲的で合併症を起こしやすく、患者への依存性が低くなっていた。しかし画像検査では、小さな病巣を診断する能力が限られており、尿中剥離細胞診の感度も低く、尿FISH検出の操作が複雑で、判読結果は主観的である。従来の腫瘍マーカー検査は、主に尿中の特定のタンパク質の存在に基づくが、尿中における検出に用いる蛋白の含有量が少ないため、感度と特異度がやはり制限されている。
【０００３】
膀胱がん特異的DNAメチル化生物指標化合物（マーカー）の組み合わせを探すことにより、複数のDNAメチル化部位に基づいて検出し、単一のDNAメチル化シグナルが低いという問題を克服することで、検出の感度および特異度を向上させる。同時にDNAメチル化に基づく検出は、簡単で実施しやすく、客観的な判読であるため、人間による判読結果の主観性を避け、精度を向上させる。またこの検出は、非侵襲的であり、膀胱鏡検査による合併症を防ぎ、患者への依存性を高めることができる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
Sambrookら、分子クローニング：実験室マニュアル（New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の目的の一つは、膀胱がんの診断に用いられることができるDNAメチル化マーカーの組み合わせを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
上記目的を達成するための技術的手段は、次の通りである。
【０００７】
膀胱がんを検出するためのDNAメチル化マーカーの組み合わせであって、［ＣＧ］により示される共メチル化部位の配列番号１～配列番号22の任意の２つ以上の配列の組み合わせから選択され、または配列番号１～配列番号22の完全に相補的な配列の任意の２つ以上の配列の組み合わせから選択される。
【０００８】
さらに、任意の２～３個、２～４個、２～５個、２～６個、２～８個、２～９個、２～10、２～11個、２～12個、２～13個、２～14個、２～15個、２～16個、２～17個、２～18個、２～19個、２～20個、２～21、２～22個のDNAメチル化マーカーの配列の組み合わせを選択できる。
【０００９】
いくつかの実施形態において、前記膀胱がんを検出するためのDNAメチル化マーカーの組み合わせは、配列番号２、配列番号３、配列番号６、配列番号13、配列番号14、配列番号15、配列番号17から選択される少なくとも２つの組み合わせ、または配列番号２、配列番号３、配列番号６、配列番号13、配列番号14、配列番号15、配列番号17の完全に相補的な配列から選択される少なくとも２つの組み合わせを含む。
【００１０】
いくつかの実施形態において、前記膀胱がんを検出するためのDNAメチル化マーカーの組み合わせは、配列番号１と配列番号２の組み合わせ、またはこれらの完全に相補的な配列の組み合わせである。
（【００１１】以降は省略されています）

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