特許ウォッチ

公開番号2025016589
公報種別公開特許公報(A)
公開日2025-02-04
出願番号2024188891,2023142679
出願日2024-10-28,2018-12-27
発明の名称CRISPR活性化による人工多能性細胞の生成
出願人ザジェイ. デビッドグラッドストーンインスティテューツ、アテスタメンタリートラストエスタブリッシュドアンダーザウィルオブジェイ. デビッドグラッドストーン
代理人弁理士法人谷川国際特許事務所
主分類C12N 5/10 20060101AFI20250128BHJP(生化学;ビール;酒精;ぶどう酒;酢;微生物学;酵素学;突然変異または遺伝子工学)
要約【課題】転写因子の異所性発現に依存することなく、内因性遺伝子座を標的とし、再構築することにより、成体の体細胞を人工多能性幹細胞に再プログラミングするための方法および組成物を提供する。
【解決手段】人工多能性幹細胞(iPSC)を生成する方法であって、(a)非iPSCにおいて、少なくとも1つのシングルガイドRNA(sgRNA)を使用して、少なくとも1つの内因性遺伝子座を標的にすることと、(b)CRISPR活性化系および前記少なくとも1つのsgRNAを使用して、前記非iPSC中の前記内因性遺伝子座を再構築すること、を含み、これにより、iPSCを生成する、方法である。
【選択図】図1-1
特許請求の範囲【請求項１】
人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）を生成する方法であって、
（ａ）非ｉＰＳＣにおいて、少なくとも１つのシングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）を使用して、少なくとも１つの内因性遺伝子座を標的にすることと、
（ｂ）ＣＲＩＳＰＲ活性化系および前記少なくとも１つのｓｇＲＮＡを使用して、前記非ｉＰＳＣ中の前記内因性遺伝子座を再構築すること、を含み、
これにより、ｉＰＳＣを生成する、方法。
続きを表示（約 2,100 文字）【請求項２】
（ａ）前記少なくとも１つの内因性遺伝子座は、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、ｃ－Ｍｙｃ、Ｎｒ５ａ２、Ｇｌｉｓ１、Ｃｅｂｐａ、Ｌｉｎ２８、Ｎａｎｏｇ、またはそれらの任意の組み合わせであり、
（ｂ）前記少なくとも１つの内因性遺伝子座は、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、ｃ－Ｍｙｃ、Ｌｉｎ２８、およびＮａｎｏｇの組み合わせを含み、
（ｃ）前記少なくとも１つのｓｇＲＮＡは、Ｏｃｔ４プロモーター、Ｏｃｔ４エンハンサー、Ｓｏｘ２プロモーター、Ｋｌｆ４プロモーター、ｃ－Ｍｙｃプロモーター、Ｌｉｎ２８プロモーター、Ｎａｎｏｇプロモーター、ＥＥＡモチーフ、またはそれらの組み合わせを標的とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
（ａ）前記内因性遺伝子座はＯｃｔ４であり
（ｂ）前記内因性遺伝子座はＳｏｘ２であり、
（ｃ）Ｏｃｔ４プロモーターを標的とする前記ｓｇＲＮＡは、配列番号１～６、５７、および５８から選択され、
（ｄ）Ｏｃｔ４エンハンサーを標的とする前記ｓｇＲＮＡは、配列番号７～１１から選択され、
（ｅ）Ｓｏｘ２プロモーターを標的とする前記ｓｇＲＮＡは、配列番号１２～２１および５９から選択され、
（ｆ）Ｋｌｆ４プロモーターを標的とする前記ｓｇＲＮＡは、配列番号２２～３１、および６０から選択され、
（ｇ）ｃ－Ｍｙｃプロモーターを標的とする前記ｓｇＲＮＡは、配列番号３２～４１および６１から選択され、
（ｈ）Ｎｒ５ａ２遺伝子を標的とする前記ｓｇＲＮＡは、配列番号４２～４５から選択され、
（ｉ）Ｇｌｉｓ１遺伝子を標的とする前記ｓｇＲＮＡは、配列番号４６～５０から選択され、
（ｊ）Ｃｅｂｐａ遺伝子を標的とする前記ｓｇＲＮＡは、配列番号５１～５６から選択され、
（ｋ）Ｌｉｎ２８プロモーターを標的とする前記ｓｇＲＮＡは、配列番号６２を含み、
（ｌ）Ｎａｎｏｇプロモーターを標的とする前記ｓｇＲＮＡは、配列番号６３を含み、および／または
（ｍ）ＥＥＡモチーフを標的とする前記ｓｇＲＮＡは、配列番号６４を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記ＣＲＩＳＰＲ活性化系は、
（ａ）少なくとも１つの転写活性化因子と融合した、不活性化ＣＲＩＳＰＲ関連ヌクレアーゼと、任意選択で、
（ｂ）不活性化ＣＲＩＳＰＲ関連ヌクレアーゼを前記少なくとも１つの転写活性化因子に連結するペプチドのタンデムアレイと、を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
（ａ）前記ＣＲＩＳＰＲ活性化系は、不活性化Ｃａｓ９（ｄＣａｓ９）を含み、
（ｂ）ペプチドの前記タンデムアレイはＳｕｎＴａｇアレイであり、
（ｃ）前記少なくとも１つの転写活性化因子は、単純ヘルペスＶＰ１６、ＶＰ１６の四量体（ＶＰ６４）、またはｐ６５を含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記非ｉＰＳＣは、
（ａ）線維芽細胞、皮膚細胞、臍帯血細胞、末梢血細胞、または腎上皮細胞、
（ｂ）哺乳動物細胞、および／または
（ｃ）ヒト細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
（ｃ）工程（ｂ）の前記細胞を、ＴＧＦβＲ阻害剤、ＧＳＫ３阻害剤、ＭＥＫ阻害剤およびＲＯＣＫ阻害剤を含む小分子と接触させることと、任意選択で、
（ｄ）前記生成されたｉＰＳＣを、ＧＳＫ３阻害剤、ＭＥＫ阻害剤およびＲＯＣＫ阻害剤を含むがＴＧＦβＲ阻害剤を含まない小分子と接触させることと、をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記内因性遺伝子座の前記再構築は、前記再構築なしの場合と比較して、１００倍以上のレベルの遺伝子発現をもたらす、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
ｉＰＳＣを生成する方法であって、
（ａ）非ｉＰＳＣにおいて、Ｓｏｘ２遺伝子を標的とするｓｇＲＮＡ、Ｏｃｔ４プロモーターを標的とするｓｇＲＮＡ、および任意選択でＯｃｔ４エンハンサーを標的とするｓｇＲＮＡまたはＥＥＡモチーフを標的とするｓｇＲＮＡのうちの少なくとも１つを使用して、少なくとも１つの内因性遺伝子座を標的とすることと、
（ｂ）ＣＲＩＳＰＲ活性化系と、Ｓｏｘ２遺伝子を標的とするｓｇＲＮＡ、Ｏｃｔ４プロモーターを標的とするｓｇＲＮＡ、および任意選択でＯｃｔ４エンハンサーを標的とするｓｇＲＮＡまたはＥＥＡモチーフを標的とするｓｇＲＮＡのうちの前記少なくとも１つを使用して、前記内因性遺伝子座を再構築することと、を含み、
これにより、ｉＰＳＣが生成される、方法。
【請求項１０】
ＣＲＩＳＰＲ活性化系の組成物であって、
（ａ）ｄＣａｓ９と、
（ｂ）前記ｄＣａｓ９に融合されたＳｕｎＴａｇアレイと、
（ｃ）前記ＳｕｎＴａｇアレイと結合したｐ３００の少なくとも１つのアセチルトランスフェラーゼ活性ドメイン（ｐ３００コア）と、を含む、組成物。
（【請求項１１】以降は省略されています）
発明の詳細な説明【技術分野】
【０００１】
関連出願
本願は、２０１７年１２月２８日に提出された米国仮出願第６２／６１１，２０２号の優先権を主張し、その開示の全体は参照により本明細書に組み込まれる。
続きを表示（約 2,800 文字）【０００２】
特定の転写因子の調節を通じて成体の体細胞を多能性幹細胞に再プログラムする能力は、基本的な生物学的研究にとって非常に重要であり、多数の疾患および障害を治療するために、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）を身体のいかなる細胞型にも分化させることができる再生医療にも大きな期待を抱かせる。この分野における継続的な課題は、転写因子の異所性発現に依存することなくｉＰＳＣを生成することであった。本開示は、内因性遺伝子座を標的化および再構築することにより、多能性幹細胞を誘導するための新規の方法および組成物を提供する。
【背景技術】
【０００３】
多能性幹細胞は、再生医療にかなり有望である。内因性クロマチンの再構築が多能性誘導にどのようにつながるかをよりよく理解することは、非常に重要である。従来、分化した体細胞は、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、およびｃ－Ｍｙｃ（ＯＳＫＭ）の異所性発現によって人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）に再プログラムできる（ＴａｋａｈａｓｈｉおよびＹａｍａｎａｋａ，２００６）。Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、およびＫｌｆ４の過剰発現は、最初にゲノム全体の内因性遺伝子座に結合し、全体的に再構築し（Ｓｏｕｆｉｅｔａｌ．，２０１２）、最終的に多能性制御回路の確立につながる。
【０００４】
しかし、内因性クロマチンへのまさにどの再構築事象が多能性に向けた再プログラミングをトリガーするかが、ほとんどわかっていない。一例として、多数の多能性関連遺伝子座の同時再構築が必要かどうか、または単一遺伝子座のまさにその再構築がｉＰＳＣ誘導に十分であるかどうかが明らかではない。加えて、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、およびＫｌｆ４は、再プログラミングに必要な多くの遺伝子の遠位要素を標的とするが（Ｓｏｕｆｉｅｔａｌ．，２０１２）、これらの遠位要素の再構築が多能性誘導にどのように影響するかはよくわかっていない。さらに、エピジェネティックな再構築は細胞再プログラミングの中心的なメカニズムであるが（Ｓｍｉｔｈｅｔａｌ．，２０１６）、ｉＰＳＣ誘導が任意の規定された内因性遺伝子座のエピジェネティックな操作によって開始できるかどうかは決定されていない。最後に、方法論的限界により、内因性遺伝子座のまさにその再構築によって多能性を誘導できるかどうかの直接的な証拠は存在しない。
【０００５】
最近、細菌由来の、タイプＩＩクラスター化された規則的に間隔を空けた短い回文反復（ＣＲＩＳＰＲ）とＣＲＩＳＰＲ関連９（Ｃａｓ９）ヌクレアーゼ系（ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系）が、哺乳動物細胞における遺伝子編集のための強力なツールとして、再度目的を果たされた（Ｃｏｎｇｅｔａｌ．，２０１３；Ｊｉｎｅｋｅｔａｌ．，２０１２；Ｍａｉｌｅｔａｌ．，２０１３ｂ）。Ｃａｓ９（ｄＣａｓ９）のヌクレアーゼ不活性化型は、トランス活性化ドメインと融合したときにプログラム可能な合成転写因子として設計されてきた。この系は、ＣＲＩＳＰＲ活性化（ＣＲＩＳＰＲａ）系と呼ばれている（Ｃｈａｖｅｚｅｔａｌ．，２０１５；Ｇｉｌｂｅｒｔｅｔａｌ．，２０１３；Ｋｏｎｅｒｍａｎｎｅｔａｌ．，２０１５；Ｔａｎｅｎｂａｕｍｅｔａｌ．，２０１４；Ｚａｌａｔａｎｅｔａｌ．，２０１５）。この系は、サイレンシングされた染色体遺伝子座を高精度で標的とし、下流の遺伝子転写を促進する先駆的因子として機能できると報告されている（Ｐｏｌｓｔｅｉｎｅｔａｌ．，２０１５）。これらの特徴により、ＣＲＩＳＰＲａ系は、ある系統から別の系統特異的細胞への細胞再プログラミングのための内因性クロマチン遺伝子座を正確に再構築するための有利なツールを提供する（Ｂｌａｃｋｅｔａｌ．，２０１６；Ｃｈａｋｒａｂｏｒｔｙｅｔａｌ．，２０１４）。しかし、この系が、すべての系統の細胞に対してあらゆる範囲の分化能を有する人工多能性幹細胞を生成できるかどうか、および／またはこの系をどのように機能させることができるかは不明である。
【発明の概要】
【０００６】
本開示は、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）が体細胞の選択的内因性遺伝子座を標的化することおよび再構築することによって生成できるという本発明の発見に基づいており、そして本開示は、部分的に、非ｉＰＳＣにおいて少なくとも１つのシングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）を使用して、少なくとも１つの内因性遺伝子座を標的にすることと、ならびに、ｉＰＳＣを生成するために、ＣＲＩＳＰＲ活性化系および少なくとも１つのｓｇＲＮＡを使用して、非ｉＰＳＣ中の選択的内因性遺伝子座を再構築することを含む、ｉＰＳＣを生成する方法に向けられている。いくつかの実施形態では、ｉＰＳＣを生成する上記の方法は、再プログラミングを受けている非ｉＰＳＣ細胞を、ＴＧＦβＲ阻害剤、ＧＳＫ３阻害剤、ＭＥＫ阻害剤およびＲＯＣＫ阻害剤を含む小分子と接触させることをさらに含み、および任意で、生成されたｉＰＳＣを、ＧＳＫ３阻害剤、ＭＥＫ阻害剤およびＲＯＣＫ阻害剤を含むがＴＧＦβＲ阻害剤を含まない小分子と接触させることをさらに含む。
【０００７】
いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ活性化系は、少なくとも１つの転写活性化因子と融合したヌクレアーゼ不活性化Ｃａｓ９（ｄＣａｓ９）を含む。他の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ活性化系は、ｄＣａｓ９を少なくとも１つの転写活性化因子に連結するペプチドのタンデムアレイをさらに含む。一実施形態では、ペプチドのタンデムアレイはＳｕｎＴａｇアレイである。一実施形態では、少なくとも１つの転写活性化因子は、単純ヘルペスＶＰ１６転写活性化因子ドメイン（ＶＰ６４）の四量体である。一実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ活性化系は、ｄＣａｓ９－ＳｕｎＴａｇ－ＶＰ６４である。
【０００８】
他の態様では、本開示は、ｄＣａｓ９、ｄＣａｓ９に融合されたＳｕｎＴａｇアレイ、およびＳｕｎＴａｇアレイと結合したｐ３００の少なくとも１つのアセチルトランスフェラーゼ活性ドメイン（ｐ３００コア）を含むＣＲＩＳＰＲ活性化系を提供する。
【０００９】
他の態様では、本開示は、ｄＣａｓ９、ＳｕｎＴａｇアレイ、およびｐ３００コアを含むＣＲＩＳＰＲ活性化系を使用してｉＰＳＣを生成する方法を提供する。
【００１０】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つの内因性遺伝子座は、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、ｃ－Ｍｙｃ、Ｌｉｎ２８、Ｎａｎｏｇ、Ｎｒ５ａ２、Ｇｌｉｓ１、Ｃｅｂｐａ、またはそれらの任意の組み合わせである。
（【００１１】以降は省略されています）

関連特許