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公開番号2025015662
公報種別公開特許公報(A)
公開日2025-01-30
出願番号2024199148,2023120137
出願日2024-11-14,2018-11-22
発明の名称改変型トランスグルタミナーゼ
出願人天野エンザイム株式会社
代理人個人,個人,個人
主分類C12N 9/10 20060101AFI20250123BHJP(生化学;ビール;酒精;ぶどう酒;酢;微生物学;酵素学;突然変異または遺伝子工学)
要約【課題】トランスグルタミナーゼの改良に有効な新たな変異を見出し、有用性の高い改変型のトランスグルタミナーゼを提供することを課題とする。
【解決手段】温度安定性の低下、耐熱性の向上、抗酸化性の向上、反応性の向上又は脱アミド酵素化をもたらすアミノ酸置換を施した有用性の高い改変型トランスグルタミナーゼが開示される。
【選択図】なし
特許請求の範囲【請求項１】
配列番号１のアミノ酸配列において、以下の(1)～(12)の中のいずれか一つのアミノ酸置換を含むアミノ酸配列、又は該アミノ酸配列と90%以上の同一性を示すアミノ酸配列（但し、前記アミノ酸置換の位置以外の部分でアミノ酸配列の相違が生じている）を有し、前記アミノ酸置換に対応した特性変化が認められる改変型トランスグルタミナーゼ：
(1)変異点がV6、置換後のアミノ酸がQ、I、M、S、C、K、L、H、F、G、N、R、W又はY、アミノ酸置換による特性変化が温度安定性低下；
(2)変異点がL60、置換後のアミノ酸がI、M、V、A、C、E、F、Q、S、T、W又はY、アミノ酸置換による特性変化が温度安定性低下；
(3)変異点がV67、置換後のアミノ酸がL、N、C、M、又はQ、アミノ酸置換による特性変化が温度安定性低下；
(4)変異点がF85、置換後のアミノ酸がM、アミノ酸置換による特性変化が温度安定性低下；
(5)変異点がF90、置換後のアミノ酸がC、M、H、L又はV、アミノ酸置換による特性変化が温度安定性低下；
(6)変異点がF108、置換後のアミノ酸がR、L、T、A、I、K、N又はV、アミノ酸置換による特性変化が温度安定性低下；
(7)変異点がF117、置換後のアミノ酸がM又はL、アミノ酸置換による特性変化が温度安定性低下；
(8)変異点がW203、置換後のアミノ酸がF、アミノ酸置換による特性変化が温度安定性低下；
(9)変異点がT273、置換後のアミノ酸がI、V、M、C、S、L、R、G、A、F、Y、D、K、W又はH、アミノ酸置換による特性変化が温度安定性低下；
(10)変異点がN276、置換後のアミノ酸がC、E、K、L、S、T又はV、アミノ酸置換による特性変化が温度安定性低下；
(11)変異点がY310、置換後のアミノ酸がC、M又はI、アミノ酸置換による特性変化が温度安定性低下；
(12)変異点がL60、置換後のアミノ酸がI、アミノ酸置換による特性変化が温度安定性低下及び反応性向上；
続きを表示（約 320 文字）【請求項２】
請求項１に記載の改変型トランスグルタミナーゼをコードする遺伝子。
【請求項３】
請求項２に記載の遺伝子を含む組換えDNA。
【請求項４】
請求項３に記載の組換えDNAを保有する微生物。
【請求項５】
請求項１に記載の改変型トランスグルタミナーゼを含む酵素剤。
【請求項６】
以下のステップ(I)～(III)を含む、改変型トランスグルタミナーゼの調製法：
(I)請求項１に記載の改変型トランスグルタミナーゼのアミノ酸配列をコードする核酸を用意するステップ；
(II)前記核酸を発現させるステップ、及び
(III)発現産物を回収するステップ。

発明の詳細な説明【技術分野】
【０００１】
本発明はトランスグルタミナーゼに関する。詳しくは、特性が変化ないし向上した改変型トランスグルタミナーゼ及びその用途等に関する。本出願は、２０１７年１１月３０日に出願された日本国特許出願第２０１７－２３１１９２号に基づく優先権を主張するものであり、当該特許出願の全内容は参照により援用される。
続きを表示（約 6,200 文字）【背景技術】
【０００２】
トランスグルタミナーゼは、ペプチド鎖内にあるグルタミン残基のγ－カルボキシルアミド基のアシル転移反応を触媒する酵素であり、アシル受容体としてタンパク質中のリジン残基のε－アミノ基が作用すると、タンパク質分子の分子内あるいは分子間においてε－（γ－Ｇｌｎ）－Ｌｙｓ架橋結合を形成させる。従って、トランスグルタミナーゼの作用を利用すればタンパク質又はペプチドの改質を行うことができるため、ストレプトミセス属由来のトランスグルタミナーゼ（例えば特許文献１を参照）が肉の結着、ソーセージ、豆腐、パン、麺類の製造に使用されている。また、食品分野に限らず、線維分野、医療分野、香粧品分野等でのトランスグルタミナーゼの利用も検討されている。このような利用拡大に伴い、トランスグルタミナーゼの特性（耐熱性、比活性、基質特異性、安定性など）を改良することが試みられている（例えば特許文献２、３、非特許文献１～４を参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
特許文献1 : 特開平４－１０８３８１号公報
特許文献2 : 特開２００２－２５３２７２号公報
特許文献3 : 特開２００８－１９４００４号公報
非特許文献
【０００４】
非特許文献1 : Marx CK et al., J Biotechnol. 2008 Sep 10;136(3-4):156-62.
非特許文献2 : Tagami U et al., Protein Eng Des Sel. 2009 Dec; 22(12): 747-752.
非特許文献3 : Yokoyama K et al., Appl Microbiol Biotechnol (2010) 87:2087-2096.
非特許文献4 : Buettner K et al., Amino Acids. 2012 Feb;42(2-3):987-96.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
上記の通り、これまでにも、耐熱性や比活性の向上等を目的としてトランスグルタミナーゼの改良が試みられているが、その有用性の高さや用途の更なる拡大等の理由から、トランスグルタミナーゼの改良に対するニーズは依然として高い。そこで本発明は、トランスグルタミナーゼの改良に有効な新たな変異を見出し、有用性の高い改変型のトランスグルタミナーゼ（変異体）及びその用途などを提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
上記課題を解決すべく本発明者らは、アミノ酸置換（特定のアミノ酸残基を別のアミノ酸へ変換すること）による、ストレプトマイセス・モバラエンシス由来のトランスグルタミナーゼの改良を試みた。試行錯誤の末、その特性の変化（温度安定性の低下、耐熱性の向上、抗酸化性の向上、反応性の向上、脱アミド酵素化）に有効な複数の変異（アミノ酸残基及び置換後のアミノ酸の組合せ）を同定することに成功した。注目すべきことに、二つ以上の特性の変化をもたらす変異も見出された。更には、このような複合的な改良が達成された変異の中には、温度安定性の低下と抗酸化性の向上という、相反するともいえる特性の変化が生じたものも存在した。この事実は極めて予想外かつ期待を超えるものであり、特筆に値する。一方、以上の成果は、トランスグルタミナーゼの改良という目的を達成し得る改変型トランスグルタミナーゼを設計、取得するための情報・手段を提供する点においても重要である。
【０００７】
ところで、効果的な二つの変異を組み合わせることによって相加的又は相乗的効果が生まれる可能性が高いことも多く経験するところである。また、同種の酵素については構造（一次構造、立体構造）の類似性が高く、同様の変異が同様の効果を生む蓋然性が高いという技術常識に鑑みれば、配列番号１のアミノ酸配列を有するストレプトマイセス・モバラエンシス由来のトランスグルタミナーゼにおいて見出された有用な変異を、当該トランスグルタミナーゼとの間で構造上の類似性が高い他のトランスグルタミナーゼに対して適用すれば、同等の効果が奏される蓋然性が高く、また、当業者であれば、このような適用が有効であることを認識し得る。
【０００８】
以下の発明は以上の成果及び考察に基づく。
［１］配列番号１のアミノ酸配列において、以下の(1)～(134)の中のいずれか一つのアミノ酸置換を含むアミノ酸配列、又は該アミノ酸配列と80%以上の同一性を示すアミノ酸配列（但し、前記アミノ酸置換の位置以外の部分でアミノ酸配列の相違が生じている）を有し、前記アミノ酸置換に対応した特性変化が認められる改変型トランスグルタミナーゼ：
(1)変異点がV6、置換後のアミノ酸がQ、I、M、S、C、K、L、H、F、G、N、P、R、W又はY、アミノ酸置換による特性変化が温度安定性低下；
(2)変異点がR26、置換後のアミノ酸がK、Q、M、H、Y、D、G、N、P又はS、アミノ酸置換による特性変化が温度安定性低下；
(3)変異点がE28、置換後のアミノ酸がV、Q、W、R、K、M、N、F、G、L、P又はY、アミノ酸置換による特性変化が温度安定性低下；
(4)変異点がV30、置換後のアミノ酸がP、C、A、E、F、G、H、K、N、Q、R、W、Y又はL、アミノ酸置換による特性変化が温度安定性低下；
(5)変異点がY34、置換後のアミノ酸がA、アミノ酸置換による特性変化が温度安定性低下；
(6)変異点がY42、置換後のアミノ酸がF、A、C、D、E、G、I、L、M、Q、S、T、V又はW、アミノ酸置換による特性変化が温度安定性低下；
(7)変異点がE58、置換後のアミノ酸がY、M、A、F、I、V、R、K、N、L、S、Q、G又はH、アミノ酸置換による特性変化が温度安定性低下；
(8)変異点がW59、置換後のアミノ酸がR、N、Y、A、S、I、V、D、G又はP、アミノ酸置換による特性変化が温度安定性低下；
(9)変異点がL60、置換後のアミノ酸がI、M、V、A、C、E、F、Q、S、T、W又はY、アミノ酸置換による特性変化が温度安定性低下；
(10)変異点がY62、置換後のアミノ酸がC、R、G、K又はS、アミノ酸置換による特性変化が温度安定性低下；
(11)変異点がV65、置換後のアミノ酸がN、L、M、F、W又はY、アミノ酸置換による特性変化が温度安定性低下；
(12)変異点がV67、置換後のアミノ酸がL、N、A、C、M、Q又はS、アミノ酸置換による特性変化が温度安定性低下；
(13)変異点がT68、置換後のアミノ酸がC、L、A、S、M、F、N、Q又はY、アミノ酸置換による特性変化が温度安定性低下；
(14)変異点がW69、置換後のアミノ酸がH、M、I、C、E、F、G、K、L、N、Q、R、S、T又はV、アミノ酸置換による特性変化が温度安定性低下；
(15)変異点がQ74、置換後のアミノ酸がW、D、G又はK、アミノ酸置換による特性変化が温度安定性低下；
(16)変異点がY75、置換後のアミノ酸がR、Q、T又はG、アミノ酸置換による特性変化が温度安定性低下；
(17)変異点がT77、置換後のアミノ酸がM、H、E、C又はG、アミノ酸置換による特性変化が温度安定性低下；
(18)変異点がF85、置換後のアミノ酸がM、アミノ酸置換による特性変化が温度安定性低下；
(19)変異点がF90、置換後のアミノ酸がC、M、H、L又はV、アミノ酸置換による特性変化が温度安定性低下；
(20)変異点がF108、置換後のアミノ酸がR、L、T、A、I、K、N又はV、アミノ酸置換による特性変化が温度安定性低下；
(21)変異点がF117、置換後のアミノ酸がM又はL、アミノ酸置換による特性変化が温度安定性低下；
(22)変異点がS199、置換後のアミノ酸がG、M、N、K又はV、アミノ酸置換による特性変化が温度安定性低下；
(23)変異点がF202、置換後のアミノ酸がL又はW、アミノ酸置換による特性変化が温度安定性低下；
(24)変異点がW203、置換後のアミノ酸がF、アミノ酸置換による特性変化が温度安定性低下；
(25)変異点がF254、置換後のアミノ酸がY又はM、アミノ酸置換による特性変化が温度安定性低下；
(26)変異点がT273、置換後のアミノ酸がI、V、M、C、S、L、R、G、A、E、F、Y、D、K、W又はH、アミノ酸置換による特性変化が温度安定性低下；
(27)変異点がN276、置換後のアミノ酸がC、E、K、L、S、T又はV、アミノ酸置換による特性変化が温度安定性低下；
(28)変異点がY278、置換後のアミノ酸がM、L、H、I、K、R、W、C、G、N、Q、S、T又はV、アミノ酸置換による特性変化が温度安定性低下；
(29)変異点がS284、置換後のアミノ酸がW、Y、M、F又はNアミノ酸置換による特性変化が温度安定性低下；
(30)変異点がY291、置換後のアミノ酸がI、W、L、A、C、K、N、Q、R、S又はV、アミノ酸置換による特性変化が温度安定性低下；
(31)変異点がS299、置換後のアミノ酸がI、Y、V、K、M、Q、A、F、G又はE、アミノ酸置換による特性変化が温度安定性低下；
(32)変異点がS303、置換後のアミノ酸がN、G、C、V、P又はY、アミノ酸置換による特性変化が温度安定性低下；
(33)変異点がY310、置換後のアミノ酸がC、M又はI、アミノ酸置換による特性変化が温度安定性低下；
(34)変異点がD3、置換後のアミノ酸がQ、P、E、S又はY、アミノ酸置換による特性変化が耐熱性向上；
(35)変異点がR26、置換後のアミノ酸がV、アミノ酸置換による特性変化が耐熱性向上；
(36)変異点がY34、置換後のアミノ酸がW、アミノ酸置換による特性変化が耐熱性向上；
(37)変異点がV67、置換後のアミノ酸がH、アミノ酸置換による特性変化が耐熱性向上；
(38)変異点がT68、置換後のアミノ酸がV又はI、アミノ酸置換による特性変化が耐熱性向上；
(39)変異点がQ74、置換後のアミノ酸がF、アミノ酸置換による特性変化が耐熱性向上；
(40)変異点がT77、置換後のアミノ酸がQ、アミノ酸置換による特性変化が耐熱性向上；
(41)変異点がS199、置換後のアミノ酸がC又はQ、アミノ酸置換による特性変化が耐熱性向上；
(42)変異点がT273、置換後のアミノ酸がQ、アミノ酸置換による特性変化が耐熱性向上；
(43)変異点がS284、置換後のアミノ酸がL、H、K、P又はR、アミノ酸置換による特性変化が耐熱性向上；
(44)変異点がS299、置換後のアミノ酸がN、アミノ酸置換による特性変化が耐熱性向上；
(45)変異点がS303、置換後のアミノ酸がK、アミノ酸置換による特性変化が耐熱性向上；
(46)変異点がD3、置換後のアミノ酸がE、Q、S又はY、アミノ酸置換による特性変化が抗酸化性向上；
(47)変異点がV6、置換後のアミノ酸がP、アミノ酸置換による特性変化が抗酸化性向上；
(48)変異点がR26、置換後のアミノ酸がM、K、W、C、Q、G、Y、E、T、N、D、I、S、P又はV、アミノ酸置換による特性変化が抗酸化性向上；
【図面の簡単な説明】
【０００９】
温度安定性低下に有効な変異点。各変異点を各種アミノ酸に置換し、置換後の酵素（変異体）の活性残存率を野生型酵素と比較することで有効なアミノ酸置換を特定した。活性測定値から、変異株の培養液1mL当たりのTG（トランスグルタミナーゼ）活性を算出し、評価に用いた。
図１の続き。
図１の続き。
図１の続き。
図１の続き。
図１の続き。
図１の続き。
耐熱性向上に有効な変異点。各変異点を各種アミノ酸に置換し、置換後の酵素（変異体）の活性残存率を野生型酵素と比較することで有効なアミノ酸置換を特定した。活性測定値から、変異株の培養液1mL当たりのTG（トランスグルタミナーゼ）活性を算出し、評価に用いた。
図２の続き。
抗酸化性向上に有効な変異点。各変異点を各種アミノ酸に置換し、置換後の酵素（変異体）の活性残存率を野生型酵素と比較することで有効なアミノ酸置換を特定した。活性測定値から、変異株の培養液1mL当たりのTG（トランスグルタミナーゼ）活性を算出し、評価に用いた。
図３の続き。
図３の続き。
反応性向上に有効な変異点。各変異点を各種アミノ酸に置換し、置換後の酵素（変異体）の活性を野生型酵素と比較することで有効なアミノ酸置換を特定した。活性測定値から、変異株の培養液1mL当たりのTG（トランスグルタミナーゼ）活性を算出し、評価に用いた。V6E/Y75FとD3P/T77Qは、２箇所でアミノ酸置換された二重変異体である。
二以上の特性の変化に有効な変異点。複合的な改良に有効な変異（アミノ酸置換）を変異点毎に示した。
図５の続き。
図５の続き。
脱アミド酵素化に有効な変異点。各変異点を各種アミノ酸に置換し、置換後の酵素（変異体）の脱アミド活性とトランスグルタミナーゼ活性の各々を、野生型酵素に対する相対値として算出した後、脱アミド活性（対野生型比率）／トランスグルタミナーゼ活性（対野生型比率）の値を求め、評価に用いた。
図６の続き。
図６の続き。
図６の続き。
図６の続き。
図６の続き。
図６の続き。
図６の続き。
図６の続き。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
説明の便宜上、本発明に関して使用する用語の一部について以下で定義する。
（用語）
用語「改変型トランスグルタミナーゼ」とは、基準となるトランスグルタミナーゼ（以下、「基準トランスグルタミナーゼ」と呼ぶ）を改変ないし変異して得られる酵素である。基準トランスグルタミナーゼは、典型的には、配列番号１のアミノ酸配列を有する、ストレプトマイセス・モバラエンシス（Streptomyces mobaraensis）由来のトランスグルタミナーゼである。
（【００１１】以降は省略されています）

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