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公開番号2025013645
公報種別公開特許公報(A)
公開日2025-01-24
出願番号2024196709,2022163736
出願日2024-11-11,2022-10-12
発明の名称シーケンシングベースのアッセイの妥当性を確保するための品質管理鋳型
出願人ビリオントゥーワン,インコーポレイテッド,BillionToOne,Inc.
代理人個人,個人,個人,個人,個人
主分類C12Q 1/6869 20180101AFI20250117BHJP(生化学;ビール;酒精;ぶどう酒;酢;微生物学;酵素学;突然変異または遺伝子工学)
要約【課題】シーケンシングベースのアッセイの妥当性を確保するための方法及び/又はシステムを提供する。
【解決手段】方法及び/又はシステムの実施形態は、品質管理鋳型(QCT)分子セットを生成すること;QCT分子セットの変動領域に基づくなど、QCT分子セットに基づきQCTシーケンスリードクラスターセットを決定すること;及びQCTシーケンスリードクラスターセットに基づき、コンタミネーションパラメータ及び/又は分子カウント数パラメータなど、シーケンシングライブラリ調製及びシーケンシングのうちの少なくとも一方に関連するシーケンシング関連パラメータを決定することを含み得る。
【選択図】図1A
特許請求の範囲【請求項１】
明細書に記載の発明。

発明の詳細な説明【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、２０１８年１月５日に出願された米国仮特許出願第６２／６１４，２３６号明
細書の利益を主張するものであり、この参照により全体として本明細書に援用される。
続きを表示（約 4,900 文字）【０００２】
本開示は、概して、遺伝子シーケンシングの技術分野に関する。
【背景技術】
【０００３】
ハイスループットシーケンシング（例えば、次世代シーケンシング（ＮＧＳ））は、全
ゲノムシーケンシング及びエクソームシーケンシングの両方とも、診断アッセイに、並び
に無侵襲的出生前遺伝学的検査（ＮＩＰＴ）、リキッドバイオプシー、及び多型を検出す
る同様のアッセイなど、より特化した適用に用いられることが多くなっている。ハイスル
ープットシーケンシング（例えば、ＮＧＳ）では、複数の試料（例えば、最大３８４試料
等）が同じシーケンシングランで処理され得るため、クロスコンタミネーションが臨床適
用上の重大な懸念である。特に、突然変異又は多型がまれで、そのアレル頻度が全体の僅
か数パーセントを占めるに過ぎないようなアッセイでは、他の試料からのクロスコンタミ
ネーションによって偽陽性が生じ得る。これは特にＮＩＰＴ及びリキッドバイオプシーに
ついて言えることであり、これらにおいては陽性と陰性とのアウトカム差が数パーセント
未満の定量差である。
【０００４】
ハイスループットシーケンシングの標準的なライブラリ調製実践では、当初の入力ＤＮ
Ａ試料の増幅が必要であり得る。検査室における突然変異アレルの増幅はいずれも、ＰＣ
Ｒキャリーオーバーコンタミネーションとして一般に知られる後続試料及び実験への混入
が起こり得るため、こうした増幅ステップによりクロスコンタミネーション効果は悪化し
得る。この問題を防ぐため、ｑＰＣＲなどの一部の標準的診断アッセイはｄＵＴＰ／ＵＮ
Ｇキャリーオーバー防止システムを利用し、ここではＰＣＲにおいてｄＴＴＰの代わりに
ｄＵＴＰが用いられ、アッセイ後、ウラシル含有アンプリコンが酵素ウラシルＤＮＡグリ
コシラーゼによる処理によって分解される。しかしながら、ハイスループットシーケンシ
ング（例えば、ＮＧＳ）は感度が一層高く、且つハイスループットシーケンシングベース
のアッセイが微小な定量的変化を測定することを考えると尚更喫緊に必要であるにも関わ
らず、ハイスループットシーケンシングベースのアッセイ（例えば、ＮＧＳベースのアッ
セイ等）に対しては、類似の解決法がない。
【０００５】
ハイスループットシーケンシングにおいてクロスコンタミネーションを完全に取り除く
ことは、関連するケミストリーに起因して困難であるが、それを追跡可能であれば、同様
に有用であり得る。複数の例において、各試料に異なる識別可能な配列が加えられてもよ
く、他のウェルへのその混入を追跡することができる。しかしながら、ユーザー毎、実験
毎、及び試料毎に配列ライブラリが異なるような例は厄介となることもあり、マルチプレ
ックス化したハイスループットシーケンシングベースのアッセイ（例えば、ＮＧＳベース
のアッセイ等）のクロスコンタミネーションの追跡に用いられる場合、大規模な複数の別
個のライブラリ（例えば、３８４通りの別個のライブラリ；同じシーケンシングランで処
理される試料の数に対応する数の別個のライブラリ；等）を管理することが必要となり得
る。その上、このような例であれば、異なる実験に同じライブラリが使用されるであろう
ため、前の実験からのＰＣＲキャリーオーバーは追跡できないであろう。更に、大規模な
複数の別個のライブラリ（例えば、３８４通りの別個のライブラリ等）の管理が困難であ
ることに起因して、識別子配列それ自体がクロスコンタミネーションを被り得る。このよ
うに、これらの限界を打破する一方で、クロスコンタミネーションの追跡のためなどの、
方法及び／又はシステムの新規の有用な実施形態が必要とされている。
【図面の簡単な説明】
【０００６】
図１Ａ－１Ｄは、ある方法の実施形態の変形形態のフローチャート図を含む。
図２は、ある方法の実施形態の変形形態のフローチャート図を含む。
図３は、ある方法の実施形態の変形形態のフローチャート図を含む。
図４Ａは、ある方法の実施形態の変形形態のバリデーション部分からの、詳細にはクロスコンタミネーション及びインデックスミスアサインメントに関する結果のグラフ図を含む。図４Ｂは、ある方法の実施形態の変形形態のバリデーション部分からの、詳細にはクロスコンタミネーション及びインデックスミスアサインメントに関する結果のグラフ図を含む。図４Ｃは、ある方法の実施形態の変形形態のバリデーション部分からの、詳細にはクロスコンタミネーション及びインデックスミスアサインメントに関する結果のグラフ図を含む。図４Ｄは、ある方法の実施形態の変形形態のバリデーション部分からの、詳細にはクロスコンタミネーション及びインデックスミスアサインメントに関する結果のグラフ図を含む。
図５Ａは、分子カウントへのＱＣＴ分子の使用についてのバリデーション実験からの結果の具体例を含む。図５Ｂは、分子カウントへのＱＣＴ分子の使用についてのバリデーション実験からの結果の具体例を含む。
図６は、技師マネジメント及び／又は検査室マネジメントに関連する品質面に関連する結果の具体例を含む。
図７Ａは、ある方法の実施形態の変形形態のバリデーション部分からの、詳細にはＱＣＴ分子の定量化に関する結果のグラフ図を含む。図７Ｂは、ある方法の実施形態の変形形態のバリデーション部分からの、詳細にはＱＣＴ分子の定量化に関する結果のグラフ図を含む。図７Ｃは、ある方法の実施形態の変形形態のバリデーション部分からの、詳細にはＱＣＴ分子の定量化に関する結果のグラフ図を含む。
図８Ａは、ある方法の実施形態の変形形態のバリデーション部分からの、詳細には生物学的標的の定量化に関する結果のグラフ図を含む。図８Ｂは、ある方法の実施形態の変形形態のバリデーション部分からの、詳細には生物学的標的の定量化に関する結果のグラフ図を含む。
図９は、ＱＣＴ分子を用いてアッセイ可能なゲノム当量を測定する具体例を含む。
図１０は、コンタミネーションパラメータを決定する具体例を含む。
図１１は、ＱＣＴ分子を複数の試料で用いて試料処理エラーを決定する具体例を含む。
図１２は、ＱＣＴ分子を異なる段階で使用する具体例を含む。
図１３Ａは、インデックスホッピングに関連する特徴付けの具体例を含む。図１３Ｂは、インデックスホッピングに関連する特徴付けの具体例を含む。
図１４は、ユニークデュアルインデックスプライマーの使用に関連する真のコンタミネーションレベルの測定を促進する具体例を含む。
図１５Ａは、単一遺伝子病の診断の促進に関連する具体例を含む。図１５Ｂは、単一遺伝子病の診断の促進に関連する具体例を含む。図１５Ｃは、単一遺伝子病の診断の促進に関連する具体例を含む。図１５Ｄは、単一遺伝子病の診断の促進に関連する具体例を含む。
図１６Ａは、染色体異常の診断の促進に関連する具体例を含む。図１６Ｂは、染色体異常の診断の促進に関連する具体例を含む。
【発明を実施するための形態】
【０００７】
本実施形態の以下の説明は、それらの実施形態に限定するのでなく、むしろ当業者によ
る作製及び使用を可能にすることを意図している。
【０００８】
１．概要。
図１Ａ～図１Ｄ及び図２～図３に示されるとおり、方法１００の実施形態（例えば、シ
ーケンシングライブラリ調製及びシーケンシングのうちの少なくとも一方に関連する特徴
付けのための；等）は、品質管理鋳型（ＱＣＴ）分子セット（例えば、各ＱＣＴ分子が標
的関連領域、変動領域等を含む）を生成することＳ１１０；ＱＣＴ分子セットに基づき（
例えば、ＱＣＴ分子セットの変動領域に基づき；等）ＱＣＴシーケンスリードクラスター
セット（例えば、ＱＣＴ分子セットに対応する；等）を（例えば、計算的に；等）決定す
ることＳ１２０；及び／又はＱＣＴシーケンスリードクラスターセットに基づき、シーケ
ンシングライブラリ調製及びシーケンシングのうちの少なくとも一方に関連するシーケン
シング関連パラメータ（例えば、コンタミネーションパラメータ、分子カウント数パラメ
ータ等）を決定することＳ１３０を含み得る。
【０００９】
加えて又は代わりに、方法１００の実施形態は、１つ以上の配列ライブラリを調製する
ことＳ１１２；１つ以上の配列ライブラリをシーケンシングすることＳ１１４；１つ以上
の病態（例えば、遺伝的障害等）の１つ以上の診断を促進すること（例えば、補助するこ
と、決定すること、提供すること等）Ｓ１４０（例えば、１つ以上のシーケンシング関連
パラメータに基づく；等）；シーケンシング関連パラメータ、診断、及び／又は他の好適
な構成要素に基づくなどして、１つ以上の病態に対する治療を促進すること（例えば、補
助すること、決定すること、提供すること、投与すること等）Ｓ１５０；及び／又は任意
の他の好適なプロセスを含み得る。
【００１０】
具体例において、方法１００（例えば、妊婦に関連する母体試料からの遺伝的障害の出
生前診断を促進するための；等）は、遺伝的障害に関連するＱＣＴ分子セットを母体試料
に加えることであって、ＱＣＴ分子セットが、内因性標的分子（例えば、遺伝的障害に関
連する；等）の標的配列領域との配列類似性がある標的関連領域と、内因性標的分子の配
列領域との配列非類似性がある変動領域（例えば、可変「Ｎ」塩基セットを含む埋め込み
分子識別子（ｅｍｂｅｄｄｅｄｍｏｌｅｃｕｌａｒｉｄｅｎｔｉｆｉｅｒ：ＥＭＩ）
領域を含む、ここで各「Ｎ」塩基は、「Ａ」塩基、「Ｇ」塩基、「Ｔ」塩基、及び「Ｃ」
塩基のいずれか１つから選択される等）とを含むこと；ＱＣＴ分子セットと標的配列領域
を含む核酸分子（例えば、核酸；核酸断片；等）とを共増幅することに基づき共増幅混合
物を生成すること；共増幅混合物をシーケンシングすること；シーケンシングからのＱＣ
Ｔ分子シーケンスリードから検出される別個の変動領域の数に基づき、ＱＣＴ分子セット
のユニークな数を計算的に決定することであって、ＱＣＴ分子シーケンスリードがＱＣＴ
分子セットに対応すること；ＱＣＴ分子シーケンスリードの数をユニークなＱＣＴ分子数
で除すことに基づき平均ＱＣＴシーケンシング深度を計算すること；内因性標的分子につ
いての総リードカウント数を平均ＱＣＴシーケンシング深度で除すことに基づき内因性標
的分子の絶対カウント数を決定すること；内因性リファレンス分子についての総リードカ
ウント数を平均ＱＣＴシーケンシング深度で除すことに基づき内因性リファレンス分子の
絶対カウント数を決定すること；及び内因性標的配列の絶対カウント数と内因性リファレ
ンス配列の絶対カウント数との間の比較に基づき遺伝的障害の出生前診断を促進すること
を含み得る。
（【００１１】以降は省略されています）

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