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公開番号2025011242
公報種別公開特許公報(A)
公開日2025-01-23
出願番号2024179303,2021552231
出願日2024-10-11,2020-03-23
発明の名称誘導平滑筋細胞を得るための方法
出願人インノヴァセルゲーエムベーハー
代理人弁理士法人牛木国際特許事務所
主分類C12N 5/077 20100101AFI20250116BHJP(生化学;ビール;酒精;ぶどう酒;酢;微生物学;酵素学;突然変異または遺伝子工学)
要約【課題】本発明は、誘導平滑筋細胞(iSMC)を得るための方法、得られたiSMC、疾患や障害を治療する方法に使用するためまたは組織工学に使用するためのiSMC、およびiSMCを得るための骨格筋由来の細胞の使用を提供する。
【解決手段】誘導平滑筋細胞(iSMC)を取得するためのインビトロまたはエクスビボの方法であって、
(a)対象から骨格筋由来細胞を取得するステップ、
(b)TGF-ベータ、特にTGFb1、TGFb2および/またはTGFb3、より好ましくはTGFb1および/またはTGFb3、最も好ましくはTGFb1、およびヘパリンを含む培地で細胞を培養することによって骨格筋由来細胞を分化転換させてiSMCを得るステップを含む方法、とする。
【選択図】なし
特許請求の範囲【請求項１】
誘導平滑筋細胞（iSMC）を取得するためのインビトロまたはエクスビボの方法であって、
（ａ）対象から骨格筋由来細胞を取得するステップ、
（ｂ）TGF-ベータ、特にTGFb1、TGFb2および／またはTGFb3、より好ましくはTGFb1および／またはTGFb3、最も好ましくはTGFb1、およびヘパリンを含む培地で細胞を培養することによって骨格筋由来細胞を分化転換させてiSMCを得るステップ
を含む方法。
続きを表示（約 970 文字）【請求項２】
ステップ（ｂ）で得られたiSMCは、非融合コンピテントであり、および／またはaSMA、CD49a、およびCD146の陽性発現によって特徴付けられる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
骨格筋由来細胞は、CD56およびデスミンの陽性発現、およびCD34の陰性発現によって特徴付けられる筋形成前駆細胞（MPC）であり、
あるいは、骨格筋由来細胞は、CD105、CD73の陽性発現、およびCD34およびCD56の陰性発現によって特徴付けられる間葉系間質細胞（MSC）である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
ステップ（ｂ）においてMPCから得られたiSMCは、aSMA、CD49a、デスミン、CD56、およびCD146の陽性発現、およびCD34の陰性発現によって特徴付けられ、
ステップ（ｂ）においてMSCから得られたiSMCは、aSMA、CD49aおよびCD146の陽性発現、およびCD56の陰性発現によって特徴付けられる、請求項１～３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
ステップ（ａ）の後に、骨格筋由来細胞を増殖させて、好ましくは20～40×10
6
個の細胞を受け取ることを含むステップ（ａ１）が行われる、請求項１～４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
ステップ（ｂ）は、１日から６日間行われる、請求項１～５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
請求項１～６のいずれかに記載の方法によって得られた誘導平滑筋細胞（iSMC）。
【請求項８】
aSMA、デスミン、CD56、CD49aおよびCD146の陽性発現、およびCD34の陰性発現によって特徴付けられるMPCから得られた誘導平滑筋細胞（iSMC）。
【請求項９】
aSMA、CD49aおよびCD146の陽性発現、およびCD56の陰性発現によって特徴付けられるMSCから得られた誘導平滑筋細胞（iSMC）。
【請求項１０】
iSMCは、機能的なカルシウムおよび／またはカリウムチャネルを発現する請求項７～９のいずれかに記載の誘導平滑筋細胞（iSMC）。
（【請求項１１】以降は省略されています）
発明の詳細な説明【技術分野】
【０００１】
本発明は、誘導平滑筋細胞（iSMC）を得るための方法、iSMC、疾患や障害を治療する方法に使用するためまたは組織工学に使用するためのiSMC、およびiSMCを得るための骨格筋由来の細胞の使用に関する。
続きを表示（約 3,300 文字）【背景技術】
【０００２】
例えば、括約筋における平滑筋の変性は、便失禁などの衰弱性疾患を引き起こす可能性がある。骨格筋由来細胞（SMDC）は、外肛門括約筋や尿道括約筋などの骨格筋括約筋の再生のために診療所で効果的に使用されてきた。しかし、SMDC由来の平滑筋細胞のインビトロの平滑筋分化およびインビボの平滑筋再生能についてはほとんど知られていない。
【０００３】
括約筋は、固体および／または液体の動きを制御する円形の筋肉であり、外肛門括約筋などの骨格筋、または内肛門括約筋や幽門括約筋などの平滑筋のいずれかからなる（Al-Ali et al., 2009; Ramkumar & Schulze, 2005）。肛門と幽門の括約筋の機能不全は、それぞれ大便失禁と胃不全麻痺に関連している（Abrahamsson, 2007; Rao, 2004）。内肛門括約筋の平滑筋の変性は、大便失禁の主なタイプである受動的便失禁の既知の原因であり（Vaizey et al., 1997）、すべての便失禁患者の78％に影響を及ぼしている（Mimura et al., 2004）。生命を脅かすものではないものの、便失禁は患者の生活の質に深刻な影響を及ぼし（Meyer & Richter, 2015）、男性と女性の有病率は最大12％である（Goode et al., 2005; Quander et al., 2005）。バルキング剤の適用などの保存的治療は、失禁の重症度が高い患者での成功は限られており、外科的アプローチは罹患率と合併症の発生率が高い（J. Y. Wang & Abbas, 2013）。
【０００４】
平滑筋組織の機能は、平滑筋アクチンアルファ（aSMA）、デスミン、スムーセリン（SMTN）などの収縮性タンパク質を発現する高度に分化した平滑筋細胞の存在に依存し（Capetanaki et al., 1997; van Eys et al., 2007; J. Wang et al., 2006）、機能的電位依存性のカルシウムとカリウムのチャネルにも依存して、調節された細胞収縮の誘導を可能にする（Sanders, 2008）。平滑筋欠損症の治療のための同様の細胞の分離と使用は、有望な治療オプションかもしれない。しかし、現在、平滑筋細胞療法は市場に出回っていない。欠損した平滑筋組織を再生することができる平滑筋細胞の単離は、これらの細胞の臨床使用に取り組むための最初の前提条件である。平滑筋細胞を誘導するための最先端の方法は、供給源としての平滑筋組織の使用である。これらの一次平滑筋細胞は、受動的糞便失禁動物モデルの平滑筋再生に効果的に使用された（Bohl et al., 2017）が、一次平滑筋細胞は、生きているヒトでは自家移植治療にほとんど利用できず、本質的に不均一であり、増殖能力が制限される可能性があり（Sandison & McCarron, 2015）、したがって、ヒトの平滑筋再生の細胞治療候補としての資格はほとんどない。したがって、平滑筋細胞に分化する準備ができている高度に増殖性の幹／前駆細胞の使用にアプローチした。
【０００５】
多能性間葉系幹細胞（MSC）や人工多能性幹細胞（iPSC）などの幹細胞／前駆細胞は、平滑筋系統への分化転換能（Bajpai et al., 2012; Park et al., 2013）と、インビボでの平滑筋再生能（Li et al., 2016）を秘めていることが示されている。iPSCは特にインビトロでの平滑筋分化能と機能性において有望であり（Bajpai et al., 2012）、iPSC由来の平滑筋前駆細胞は、インビボで尿道括約筋再生能を示しました（Li et al., 2016）が、遺伝的不安定性や奇形腫形成などの、安全性への懸念は、それらの有用性を制限している（Jung et al., 2012）。成人のMSC由来の細胞製品は、大多数の臨床試験で大きな健康上の懸念を引き起こさなかった（Y. Wang et al., 2012）。しかし、平滑筋の再生におけるそれらの臨床効果はとらえどころのないままである。
【０００６】
骨格筋組織は、MSCや衛星細胞由来の筋形成前駆細胞などの幹細胞および前駆細胞の供給源であることが判明しており、どちらも高度に再生すると予想されている（(Yin et al., 2013）。CD56陽性細胞が豊富な骨格筋由来細胞（SMDC）は、診療所での便失禁に関連する外肛門括約筋の衰弱を改善することが示されている（A. Frudinger et al., 2010, 2015; Andrea Frudinger et al., 2018）。さらに、骨格筋由来の細胞が膀胱排尿筋に生着し、膀胱機能を改善することが見出された（Huard et al., 2002）。しかし、平滑筋細胞の分化と単離、またはインビボでのそれらの再生能力に関するSMDCに関する知識は限られており（Lu et al., 2011）、括約筋平滑筋の再生のためのSMDC由来の平滑筋細胞（誘導平滑筋細胞）の治療可能性を評価した研究はない。
【０００７】
平滑筋組織の再生のための細胞治療アプローチは、非常に望ましく、平滑筋再生に有能な細胞の使用に依存している。従来技術の方法の欠点を考慮して、平滑筋細胞を提供するための新しい方法が必要とされている。
【０００８】
Frudinger et al. (2018)は、Frudinger et al. (2018)の図６に示されているように、SMDCと呼ばれるCD56+骨格筋由来細胞の分離を教示している（Andrea Frudinger et al., 2018）。前記細胞は、とりわけ、本開示の図１５に示されるように、aSMA、CD49a、CD146ａの陰性発現によって特徴付けられる。さらに、Frudinger et al. (2018)に記載されているように、SMDCは、Pax-7の陽性発現によって特徴付けられる（Andrea Frudinger et al., 2018）。Frudinger et al. (2018)に記載されているSMDCは、骨格筋原生形成性であり、すなわち、それらは多核筋管に融合することができる。
【０００９】
EP 2 206 774 A1は、筋肉組織、より具体的には骨格筋組織および／または心筋組織、好ましくは筋内膜および／または心臓組織からの単離によって得られる分化能力を有する細胞集団に関する（Marolleau et al., 2010）。EP 2 206 774 A1の細胞集団は、ALDH陽性細胞を含み、特に筋原性および／または脂肪生成性および／または骨形成性の分化能を有している。特に、EP 2 206 774 A1は、EP 2 206 774 A1の表１、表３、図８に示されているように、すべてCD146-である、ALDH+/CD34-セル、ALDH+/CD34+セル、およびSMALD/34+セルを開示している。さらに、EP 2 206 774A1は、SMALD/34-セルを開示している。上記の細胞は、EP 2 206 774 A1の図３に示されているように、CD146+であって融合コンピテントである。
【００１０】
Lecourt S et al. (2010)は、ヒトの骨格筋が潜在的な治療の見通しを持つ様々な細胞前駆細胞の本質的な源であることを調ベている。一方では、CD49a-およびCD49e +であるCD56+セルが記載されている。他方、CD146-およびSMA-であるCD56-細胞が記載されている（Lecourt et al., 2010）。
（【００１１】以降は省略されています）

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