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公開番号2025010253
公報種別公開特許公報(A)
公開日2025-01-20
出願番号2024189111,2022176371
出願日2024-10-28,2018-09-07
発明の名称修飾型閉端DNA(CEDNA)
出願人ジェネレーションバイオカンパニー
代理人個人,個人,個人,個人,個人
主分類C12N 15/63 20060101AFI20250109BHJP(生化学;ビール;酒精;ぶどう酒;酢;微生物学;酵素学;突然変異または遺伝子工学)
要約【課題】修飾型閉端DNA(CEDNA)の提供。
【解決手段】直鎖状で連続的な構造を有するceDNAベクターは、高収率で産生され、導入遺伝子の有効な移動および発現に使用され得る。ceDNAベクターは、発現カセットと、AAVゲノムに由来する2つの異なるITR配列と、を指定された順序で含む。本明細書に提供されるいくつかのceDNAベクターは、シス調節エレメントをさらに含み、高い遺伝子発現効率をもたらす。さらに、直鎖状で連続的なカプシド不含DNAベクターの確実かつ効率的な産生のための方法および細胞株が本明細書に提供される。
【選択図】なし
特許請求の範囲【請求項１】
共有結合性閉端を有する非ウイルス性カプシド不含ＤＮＡベクター（ｃｅＤＮＡベクター）であって、前記ｃｅＤＮＡベクターが、非対称逆位末端反復配列（非対称ＩＴＲ）の間に操作可能に位置付けられた少なくとも１つの異種ヌクレオチド配列を含み、前記非対称ＩＴＲのうちの少なくとも１つが、機能的末端分解部位およびＲｅｐ結合部位を含む、ｃｅＤＮＡベクター。

発明の詳細な説明【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、米国特許法第１１９条（ｅ）の下、各々２０１７年９月８日出願の米国仮特許出願第６２／５５６，３１９号、同第６２／５５６，３２４号、同第６２／５５６，３２９号、同第６２／５５６，３３１号、同第６２／５５６，２８１号、および同第６２／５５６，３３５号の利益を主張し、各々の内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
続きを表示（約 4,000 文字）【０００２】
配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩフォーマットで電子的に提出され、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる配列表を含む。２０１８年９月７日に作成された前述のＡＳＣＩＩコピーは、０８０１７０－０９０５８０ＷＯＰＴ＿ＳＬ．ｔｘｔという名前が付けられ、サイズは２０５，９９１バイトである。
【０００３】
本発明は、標的細胞、組織、器官、または生物への外因性ＤＮＡ配列の送達を含む、遺伝子療法の分野に関する。
【背景技術】
【０００４】
遺伝子療法は、遺伝子発現プロファイルにおける異常によって引き起こされる遺伝子突然変異または後天性疾患のいずれかを罹患している患者の臨床転帰を改善することを目的とする。遺伝子療法は、欠損遺伝子、または障害、疾患、悪性腫瘍等をもたらし得る異常調節もしくは発現、例えば過小発現もしくは過剰発現から生じる医学的状態の治療または予防を含む。例えば、欠損遺伝子によって引き起こされる疾患または障害は、患者の体内で遺伝物質の治療的発現をもたらす、患者への補正遺伝物質の送達によって治療、予防、または改善され得る。遺伝子療法の基礎は、転写カセットに活性遺伝子産物（導入遺伝子と称される場合がある）を供給することであり、例えば、正の機能獲得効果、負の機能喪失効果、または例えば腫瘍溶解効果などの別の結果をもたらし得る。遺伝子療法を使用して、他の要因によって引き起こされる疾患または悪性腫瘍を治療することもできる。ヒト単一遺伝子障害は、標的細胞への正常遺伝子の送達および発現によって治療され得る。患者の標的細胞中の補正遺伝子の送達および発現は、操作されたウイルスおよびウイルス遺伝子送達ベクターの使用を含む、多くの方法を介して実行され得る。使用可能な多くのウイルス由来ベクター（例えば、組み換えレトロウイルス、組み換えレンチウイルス、組み換えアデノウイルス等）の中で、組み換えアデノ関連ウイルス（ｒＡＡＶ）は、遺伝子療法において多用途ベクターとして人気を集めている。
【０００５】
アデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）は、パルボウイルス科に属し、より具体的にはディペンドパルボウイルス属を構成する。ＡＡＶゲノムは、およそ４．７キロベース（ｋｂ）を含み、非構造的Ｒｅｐ（複製）および構造的Ｃａｐ（カプシド）タンパク質をコードする２つの主要なオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）からなる直鎖状一本鎖ＤＮＡ分子で構成されている。アセンブリー活性化タンパク質（ＡＡＰ）をコードするキャップ遺伝子内の第２のＯＲＦが特定された。ＡＡＶコード領域に隣接するＤＮＡは、およそ１４５ヌクレオチド長の２つのシス作用性逆位末端反復（ＩＴＲ）配列であり、ＤＮＡ複製のプライマーとして機能するエネルギー的に安定したヘアピン構造に折り畳まれ得る中断パリンドローム配列を有する。ＤＮＡ複製におけるそれらの役割に加えて、ＩＴＲ配列は、細胞ゲノム中のウイルスＤＮＡ組み込み、宿主ゲノムまたはプラスミドからのレスキュー、および成熟ビリオン中のウイルス核酸のカプシド化に関与することが示された（Ｍｕｚｙｃｚｋａ，（１９９２）Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｉｃｒｏ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５８：９７－１２９）。
【０００６】
ＡＡＶ由来のベクター（すなわち、組み換えＡＡＶ（ｒＡＶＶ）またはＡＡＶベクター）は、（ｉ）それらが筋細胞およびニューロンを含む多種多様な非分裂および分裂細胞型に感染する（形質導入する）ことができるため、（ｉｉ）それらがウイルス構造遺伝子を欠いていることによって、ウイルス感染に対する宿主細胞反応、例えばインターフェロン媒介性反応を減少させるため、（ｉｉｉ）野生型ウイルスが、ヒトにおいて非病理的であるとみなされるため、（ｉｖ）宿主細胞ゲノム中に組み込むことができる野生型ＡＡＶと対照的に、複製欠損ＡＡＶベクターは、ｒｅｐ遺伝子を欠き、一般にエピソームとして持続し、したがって挿入変異または遺伝毒性の危険性を制限するため、ならびに（ｖ）他のベクター系と比較して、ＡＡＶベクターは、一般に比較的不良な免疫原であるとみなされるため、著しい免疫反応を誘起せず（ｉｉを参照）、したがって治療導入遺伝子のベクターＤＮＡおよび潜在的に長期発現の持続を得るため、遺伝物質を送達するために魅力的である。ＡＡＶベクターはまた、高力価で産生および製剤化され、動脈内、静脈内、または腹腔内注入を介して送達され得、齧歯類（Ｇｏｙｅｎｖａｌｌｅｅｔａｌ．，２００４、Ｆｏｕｇｅｒｏｕｓｓｅｅｔａｌ．，２００７、Ｋｏｐｐａｎａｔｉｅｔａｌ．，２０１０、Ｗａｎｇｅｔａｌ．，２００９）およびイヌにおける単回注入による重要な筋領域へのベクター分布および遺伝子導入を可能にする。脊髄性筋萎縮症１型を治療するための臨床研究では、ＡＡＶベクターを、脳を標的とし、明らかな臨床改善をもたらすことを意図して、全身的に送達した。
【０００７】
しかしながら、ＡＡＶ粒子を遺伝子送達ベクターとして使用することには、いくつかの重大な欠陥が存在する。ｒＡＡＶに関連する１つの重大な欠点は、約４．５ｋｂの異種ＤＮＡの制限されたウイルスパッケージング能力である（Ｄｏｎｇｅｔａｌ．，１９９６、Ａｔｈａｎａｓｏｐｏｕｌｏｓｅｔａｌ．，２００４、Ｌａｉｅｔａｌ．，２０１０）。結果として、ＡＡＶベクターの使用は、１５０，０００Ｄａ未満のタンパク質コード能力に制限されている。第２の欠点は、集団における野生型ＡＡＶ感染の流行の結果として、ｒＡＡＶ遺伝子療法の候補を、患者からベクターを排除する中和抗体の存在についてスクリーニングする必要があることである。第３の欠点は、初回治療から排除されなかった患者への再投与を予防するカプシド免疫原性に関する。患者における免疫系は、「ブースター」ショットとして有効に作用するベクターに反応して、将来の治療を妨げる高力価抗ＡＡＶ抗体を生成する免疫系を刺激し得る。いくつかの最近の報告は、高用量状況における免疫原性との関係を示している。一本鎖ＡＡＶＤＮＡが異種遺伝子発現前に二本鎖ＤＮＡに変換されなければならないことを考えると、別の顕著な欠点は、ＡＡＶ媒介性遺伝子発現の始まりが比較的遅いことである。二本鎖ＤＮＡベクターを構築することによって、この問題を回避することが試みられているが、この戦略は、ＡＡＶベクターに組み込まれ得る導入遺伝子発現カセットのサイズをさらに制限する（ＭｃＣａｒｔｙ，２００８、Ｖａｒｅｎｉｋａｅｔａｌ．，２００９、Ｆｏｕｓｔｅｔａｌ．，２００９）。
【０００８】
追加として、カプシドを有する従来のＡＡＶビリオンは、ＡＡＶゲノム、ｒｅｐ遺伝子、およびｃａｐ遺伝子を含有する１つまたは複数のプラスミドを導入することによって産生される（Ｇｒｉｍｍｅｔａｌ．，１９９８）。トランスにおけるこれらのヘルパープラスミドの導入時に、ＡＡＶゲノムは、宿主ゲノムから「レスキュー」され（すなわち、放出された後に増幅され）、さらにカプシド化されて（ウイルスカプシド）、生物学的に活性なＡＡＶベクターを産生する。しかしながらそのようなカプシド化ＡＡＶウイルスベクターは、ある特定の細胞および組織型を非効率的に形質導入することがわかった。カプシドはまた、免疫反応を誘導する。
したがって、遺伝子療法のためのアデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）ベクターの使用は、（患者免疫反応に起因する）患者への単回投与、関連ＡＡＶカプシドの最小ウイルスパッケージング能力（約４．５ｋｂ）に起因するＡＡＶベクター中の送達に好適な導入遺伝子遺伝物質の制限された範囲、ならびに遅いＡＡＶ媒介性遺伝子発現に起因して制限される。ｒＡＡＶ臨床遺伝子療法のための適用は、同系マウスモデルにおける、または他のモデル種における用量反応によって予測されない患者間の変動性によってさらに妨げられる。
組み換えカプシド不含ＡＡＶベクターは、発現可能な導入遺伝子、ならびにＲｅｐ結合部位および末端分解部位を含む２つの野生型ＡＡＶ逆位末端反復配列（ＩＴＲ）によって隣接されるプロモーター領域を含む、単離された直鎖状核酸分子として取得され得る。これらの組み換えＡＡＶベクターは、ＡＡＶカプシドタンパク質をコードする配列を欠いており、２つの野生型ＩＴＲパリンドローム配列を通して共有結合された一方または両方の末端を有する一本鎖、二本鎖、または二重鎖であり得る（例えば、ＷＯ２０１２／１２３４３０、米国特許第９，５９８，７０３号）。それらは、導入遺伝子能力がはるかに高く、導入遺伝子発現の始まりが速く、患者の免疫系がＤＮＡ分子を一掃されるべきウイルスとして認識するという点で、ＡＡＶ媒介性遺伝子療法の多くを回避する。しかしながら、導入遺伝子の定常発現は、すべての例において望ましくない場合があり、ＡＡＶ正準野生型ＩＴＲは、ｃｅＤＮＡ機能のために最適化されない場合がある。したがって、向上した産生および／または発現特性を有する制御可能な組み換えＤＮＡベクターに対する重要な要求が対処されないままである。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
国際公開第２０１２／１２３４３０号
米国特許第９，５９８，７０３号明細書
【非特許文献】
【００１０】
Ｍｕｚｙｃｚｋａ，（１９９２）Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｉｃｒｏ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５８：９７－１２９
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
（【００１１】以降は省略されています）

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