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公開番号2025007962
公報種別公開特許公報(A)
公開日2025-01-20
出願番号2023108532
出願日2023-06-30
発明の名称変異型TDP-43タンパク質
出願人公益財団法人東京都医学総合研究所
代理人個人,個人
主分類C12N 15/12 20060101AFI20250109BHJP(生化学;ビール;酒精;ぶどう酒;酢;微生物学;酵素学;突然変異または遺伝子工学)
要約【課題】変異型TDP-43タンパク質の提供。
【解決手段】野生型TDP-43のアミノ酸配列において核移行シグナル配列が欠失するとともに、以下の(a)～(c)のいずれかの変異又はこれらの組み合わせの変異を有する、変異型TDP-43タンパク質。
(a)第147番目及び149番目のフェニルアラニンがロイシンに置換した変異
(b)第194番目のフェニルアラニンがロイシンに置換した変異
(c)第229番目及び231番目のフェニルアラニンがロイシンに置換した変異
【選択図】なし
特許請求の範囲【請求項１】
野生型TDP-43タンパク質のアミノ酸配列において核移行シグナル配列が欠失するとともに、以下の（ａ１）～（ｃ２）のいずれかの変異又はこれらの組み合わせの変異を有する変異型TDP-43タンパク質であって、細胞内において凝集活性を有する、前記変異型TDP-43タンパク質。
（ａ１）第147番目及び149番目のフェニルアラニンがロイシンに置換した変異
（ａ２）第147番目及び149番目のフェニルアラニンがロイシンに置換するとともに当該第147番目及び149番目のアミノ酸を除く１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加された変異
（ｂ１）第194番目のフェニルアラニンがロイシンに置換した変異
（ｂ２）第194番目のフェニルアラニンがロイシンに置換するとともに当該第194番目のアミノ酸を除く１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加された変異
（ｃ１）第229番目及び231番目のフェニルアラニンがロイシンに置換した変異
（ｃ２）第229番目及び231番目のフェニルアラニンがロイシンに置換するとともに当該第229番目及び231番目のアミノ酸を除く１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加された変異
続きを表示（約 630 文字）【請求項２】
野生型TDP-43タンパク質のアミノ酸配列が配列番号２、４、６又は８に示されるものである、請求項１に記載の変異型TDP-43タンパク質。
【請求項３】
請求項１に記載の変異型TDP-43タンパク質をコードするDNA。
【請求項４】
請求項３に記載のDNAを含むベクター。
【請求項５】
アデノ随伴ウイルスベクターである請求項４に記載のベクター。
【請求項６】
請求項１に記載の変異型TDP-43タンパク質が非ヒト哺乳動物の脳に発現された、変異型TDP-43タンパク質蓄積モデル動物。
【請求項７】
請求項１に記載の変異型TDP-43タンパク質の凝集体が細胞に導入された、変異型TDP-43タンパク質蓄積モデル細胞。
【請求項８】
変異型TDP-43タンパク質の凝集体が請求項６に記載のモデル動物の脳由来のものである、請求項７に記載のモデル細胞。
【請求項９】
変異型TDP-43タンパク質の凝集体が、当該タンパク質の細胞内蓄積のシードとして機能するシード活性を有する、請求項８に記載のモデル細胞。
【請求項１０】
請求項６に記載のモデル動物、又は請求項７に記載のモデル細胞に被検候補物質を接触又は投与することを特徴とする、神経変性疾患治療薬のスクリーニング方法。
（【請求項１１】以降は省略されています）
発明の詳細な説明【技術分野】
【０００１】
本発明は、変異型TDP-43タンパク質、並びに当該タンパク質を含む変異型ＴＤＰ－４３蓄積モデル細胞及びマウスに関する。
続きを表示（約 5,800 文字）【背景技術】
【０００２】
多くの神経変性疾患の患者脳などでは、その疾患を特徴づける細胞内凝集体が神経細胞やグリア細胞内に出現する。細胞内凝集体の主要な構成タンパク質は疾患ごとに異なっており、アルツハイマー病（AD）ではタウ、パーキンソン病（PD）やレビー小体型認知症（DLB）ではαシヌクレイン、筋萎縮性側索硬化症（ALS）や前頭側頭葉変性症（FTLD）ではTDP-43がそれぞれの疾患特異的な細胞内凝集体の主要な構成タンパク質として同定されてきた。しかしながら、細胞内で特定のタンパク質が凝集するメカニズムに関しては殆ど明らかになっていない。このため、そのメカニズムの解明を目的として、タウ、αシヌクレインやTDP-43の細胞内蓄積を再現する種々のモデルが構築されているが、患者脳におけるタンパク質蓄積病理を忠実に再現するモデルは数少ない。TDP-43に関しては、FTLD患者脳におけるユビキチン陽性の細胞内凝集体の主要な構成タンパク質であることが2006年に報告されて以来（Arai et al, 2006およびNeuman et al, 2006）、数多くのTDP-43発現マウスが開発されてきた（Wils et al, 2010）。また、TDP-43蓄積細胞モデルについての研究も行われている（特許第5667872号）
しかしながら、患者脳に見られるリン酸化TDP-43の細胞内蓄積を十分に再現するモデルは今のところ報告されておらず、その開発が待たれている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
特許第5667872号
【非特許文献】
【０００４】
Arai et al, Biochem Biophys Res Commun. 2006 Dec 22;351(3):602-11.
Neumann et al, Science. 2006 Oct 6;314(5796):130-3.
Wils H et al, Proc Natl Acad Sci U S A. 2010 Feb 23;107(8):3858-63.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
上記背景により、患者脳に見られるリン酸化TDP-43の細胞内蓄積を十分に再現するモデルの開発が求められていた。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者は、上記課題を解決するために鋭意検討を行った結果、野生型TDP-43の核移行シグナルを削除し、RNA結合ドメインの一部のアミノ酸を置換変異することにより、上記課題を解決することが可能となった。
すなわち、本発明は以下の通りである。
[１] 野生型TDP-43タンパク質のアミノ酸配列において核移行シグナル配列が欠失するとともに、以下の（ａ１）～（ｃ２）のいずれかの変異又はこれらの組み合わせの変異を有する変異型TDP-43タンパク質であって、細胞内において凝集活性を有する、前記変異型TDP-43タンパク質。
（ａ１）第147番目及び149番目のフェニルアラニンがロイシンに置換した変異
（ａ２）第147番目及び149番目のフェニルアラニンがロイシンに置換するとともに当該第147番目及び149番目のアミノ酸を除く１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加された変異
（ｂ１）第194番目のフェニルアラニンがロイシンに置換した変異
（ｂ２）第194番目のフェニルアラニンがロイシンに置換するとともに当該第194番目のアミノ酸を除く１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加された変異
（ｃ１）第229番目及び231番目のフェニルアラニンがロイシンに置換した変異
（ｃ２）第229番目及び231番目のフェニルアラニンがロイシンに置換するとともに当該第229番目及び231番目のアミノ酸を除く１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加された変異
[２] 野生型TDP-43タンパク質のアミノ酸配列が配列番号２、４、６又は８に示されるものである、[１]に記載の変異型TDP-43タンパク質。
[３] [１]に記載の変異型TDP-43タンパク質をコードするDNA。
[４] [３]に記載のDNAを含むベクター。
[５] アデノ随伴ウイルスベクターである[４]に記載のベクター。
[６] [１]に記載の変異型TDP-43タンパク質が非ヒト哺乳動物の脳に発現された、変異型TDP-43タンパク質蓄積モデル動物。
[７] [１]に記載の変異型TDP-43タンパク質の凝集体が細胞に導入された、変異型TDP-43タンパク質蓄積モデル細胞。
[８] 変異型TDP-43タンパク質の凝集体が[６]に記載のモデル動物の脳由来のものである、[７]に記載のモデル細胞。
[９] 変異型TDP-43タンパク質の凝集体が、当該タンパク質の細胞内蓄積のシードとして機能するシード活性を有する、[８]に記載のモデル細胞。
[１０] [６]に記載のモデル動物、又は[７]に記載のモデル細胞に被検候補物質を接触又は投与することを特徴とする、神経変性疾患治療薬のスクリーニング方法。
[１１] [６]に記載のモデル動物、又は[７]に記載のモデル細胞を含む、神経変性疾患治療薬のスクリーニング用キット。
【発明の効果】
【０００７】
本発明により、変異型TDP-43タンパク質が提供される。本発明の変異型タンパク質が導入された細胞やマウスは、神経変性疾患のモデル細胞又はモデル動物として有用である。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
本発明における、核酸との結合能のない変異型TDP-43タンパク質におけるアミノ酸配列の変異導入位置を示す図である。
TDP-43 FL変異体発現細胞の蛍光顕微鏡観察像である。
TDP-43 FL変異体発現細胞のイムノブロット解析結果を示す図である。プラスミド発現細胞を界面活性剤サルコシル存在下でホモジナイズして、その可溶性画分（Sar-sup)および不溶性画分（Sar-ppt）を解析した。リン酸化TDP-43特異抗体（anti-pS409/410）により、細胞内で蓄積したリン酸化TDP-43（赤矢印）がSar-ppt画分に検出された。
TDP-43 FL変異体発現細胞のイムノブロット解析の結果を示す図である。プラスミド発現細胞を界面活性剤サルコシル存在下でホモジナイズして、その可溶性画分（Sar-sup)および不溶性画分（Sar-ppt）を解析した。リン酸化TDP-43特異抗体（anti-pS409/410）により、細胞内で蓄積したリン酸化TDP-43（赤矢印）がSar-ppt画分に検出された。
マウスモデル実験の概略を示す図である。
TDP-43ΔNLS&FL-A発現AAVによるマウス脳でのTDP-43ΔNLS&FL-A発現を示す図である。TDP-43ΔNLS&FL-Aを神経細胞特異的に発現するAAVを成体マウス脳に接種して感染させた。AAV接種から1か月後に脳を摘出しイムノブロット解析を行った。回収したマウス右脳は界面活性剤の一種であるサルコシルを用いてホモジナイズした後に遠心分離を行い、サルコシル可溶性（Sar-sup）画分を得た。これらをヒトTDP-43特異抗体を用いてイムノブロットを行った。赤矢印：TDP-43ΔNLS&FL-A。1 x 10
9
vgのAAVを感染させたマウス（レーン1～5）では、目的のTDP-43ΔNLS&FL-Aの発現が認められ、1 x 10
8
vgのAAV感染マウスではその発現量は減少した（レーン6～10）。生理食塩水を接種したマウス（レーン11）では、その発現は確認できなかった。1～5：1 x 10
9
vgのAAVを感染させたマウス（計5匹）6～10：1 x 10
8
vgのAAVを感染させたマウス（計5匹）11：生理食塩水を接種したマウス
TDP-43ΔNLS&FL-Aを発現させたマウス脳のイムノブロット解析を示す図である。TDP-43ΔNLS&FL-Aを神経細胞特異的に発現するAAVを成体マウス脳に接種して感染させた。AAV接種から1か月後に脳を摘出しイムノブロット解析を行った。回収したマウス右脳は界面活性剤の一種であるサルコシルを用いてホモジナイズした後に遠心分離を行い、サルコシル不溶性（Sar-ppt）画分を得た。これらをリン酸化TDP-43抗体を用いてイムノブロットを行った。赤矢印：TDP-43ΔNLS&FL-A。1 x 10
9
vgのAAVを感染させたマウスでは、（個体差はあるが）脳内で不溶化したTDP-43ΔNLS&FL-Aが認められた。1 x 10
8
vgのAAVあるいは生理食塩水を接種したマウスでは、TDP-43の蓄積は認められなかった。1～5：1 x 10
9
vgのAAVを感染させたマウス（計5匹）6～10：1 x 10
8
vgのAAVを感染させたマウス（計5匹）11：生理食塩水を接種したマウス
TDP-43ΔNLS&FL-Aを発現させたマウス脳の免疫染色を示す図である。TDP-43ΔNLS&FL-Aを神経細胞特異的に発現するAAV（1 x 10
9
vg）を成体マウス脳に接種して感染させた。AAV接種から1か月後に脳を摘出し、その左脳をホルマリン固定した後にヒトTDP-43特異抗体を用いて免疫染色を行った。左脳を用いて免疫組織化学染色による解析を行った。その結果、海馬、内側後部頭頂皮質の神経細胞にTDP-43抗体陽性の染色像（茶色）が得られた。
TDP-43ΔNLS&FL-Aを発現させたマウス脳におけるリン酸化TDP-43の凝集体形成を示す図である。TDP-43ΔNLS&FL-Aを神経細胞特異的に発現するAAV（1 x 10
9
vg）を成体マウス脳に接種して感染させた。AAV接種から1か月後に脳を摘出し、左脳を用いてリン酸化TDP-43特異抗体による免疫組織化学染色を行った。その結果、海馬、内側後部頭頂皮質の神経細胞にリン酸化TDP-43抗体陽性の細胞内凝集体（濃い茶色の染色像）が認められた。このような染色像は、生理食塩水を摂取したマウス脳では認められない。
培養細胞を用いたAAV感染マウス脳サルコシル不溶性画分のシード活性を示す図である。TDP-43ΔNLSプラスミドを一過性に発現させたSH-SY5Y細胞に、TDP-43ΔNLS&FL-Aを発現するAAVを感染させたマウス脳から得られた不溶化TDP-43をシードとして添加した。細胞を回収した後、界面活性剤の一種であるサルコシルを用いて細胞をホモジナイズした後に遠心分離を行い、サルコシル不溶性（Sar-ppt）画分を得た。これらをリン酸化TDP-43抗体を用いてイムノブロットを行った。赤矢印：リン酸化TDP-431および2：未処理3：TDP-43ΔNLSプラスミドのみ発現4：TDP-43ΔNLSプラスミド発現＋AAV感染後1ヶ月経過後のマウス脳の不溶化TDP-435：TDP-43ΔNLSプラスミド発現＋AAV感染後3ヶ月経過後のマウス脳の不溶化TDP-436：TDP-43ΔNLSプラスミド発現＋ALS患者脳より調製した不溶化TDP-43
【発明を実施するための形態】
【０００９】
１．概要
本発明は、野生型TDP-43のアミノ酸配列において核移行シグナル配列が欠失するとともに、以下の（ａ１）～（ｃ２）のいずれかの変異又はこれらの組み合わせの変異を有する変異型TDP-43タンパク質であって、細胞内において凝集活性を有する、前記変異型TDP-43タンパク質に関する。
（ａ１）第147番目及び149番目のフェニルアラニンがロイシンに置換した変異
（ａ２）第147番目及び149番目のフェニルアラニンがロイシンに置換するとともに当該第147番目及び149番目のアミノ酸を除く１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加された変異
（ｂ１）第194番目のフェニルアラニンがロイシンに置換した変異
（ｂ２）第194番目のフェニルアラニンがロイシンに置換するとともに当該第194番目のアミノ酸を除く１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加された変異
（ｃ１）第229番目及び231番目のフェニルアラニンがロイシンに置換した変異
（ｃ２）第229番目及び231番目のフェニルアラニンがロイシンに置換するとともに当該第229番目及び231番目のアミノ酸を除く１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加された変異
【００１０】
本発明者らは、RNAに結合できない変異型TDP-43を培養細胞に発現すると、それが細胞内においてリン酸化を受けて蓄積することを見出した。さらに、この変異型TDP-43をコードしたアデノ随伴ウイルス（AAV）を調製してマウス脳内に接種すると、脳内においてリン酸化TDP-43陽性の細胞内凝集体が観察されることを確認した。この新たな変異型TDP-43を発現するマウスモデルは、細胞内でTDP-43が蓄積するメカニズムの解明のみならず、ALSやFTLDなどの治療薬・予防法の開発にも有用と考えられる。
（【００１１】以降は省略されています）

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