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公開番号2024179802
公報種別公開特許公報(A)
公開日2024-12-26
出願番号2023098942
出願日2023-06-16
発明の名称カビ臭抑制剤の評価及び/又は選択方法
出願人花王株式会社
代理人弁理士法人アルガ特許事務所
主分類C12Q 1/02 20060101AFI20241219BHJP(生化学;ビール;酒精;ぶどう酒;酢;微生物学;酵素学;突然変異または遺伝子工学)
要約【課題】カビ臭を選択的に抑制することができる物質の探索。
【解決手段】試験物質添加後のOR8S1及びこれと同等の機能を有するポリペプチドからなる群より選択される少なくとも1種の嗅覚受容体ポリペプチドの応答を測定することを含む、カビ臭抑制剤の評価及び/又は選択方法。
【選択図】なし
特許請求の範囲【請求項１】
試験物質添加後のＯＲ８Ｓ１及びこれと同等の機能を有するポリペプチドからなる群より選択される少なくとも１種の嗅覚受容体ポリペプチドの応答を測定することを含む、カビ臭抑制剤の評価及び／又は選択方法。
続きを表示（約 1,100 文字）【請求項２】
前記カビ臭の原因物質がジオスミン及び２－メチルイソボルネオールからなる群より選択される少なくとも１種である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記ＯＲ８Ｓ１が配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドである、請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
前記ＯＲ８Ｓ１と同等の機能を有するポリペプチドが、配列番号１で示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつジオスミン及び２－メチルイソボルネオールからなる群より選択される少なくとも１種に応答性を有するポリペプチドである、請求項１～３のいずれか１項記載の方法。
【請求項５】
前記ＯＲ８Ｓ１と同等の機能を有するポリペプチドが、配列番号１で示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号１で示されるアミノ酸配列の下記表１の（１）の各アミノ酸位置に相当する位置の少なくとも１箇所に（２）のアミノ酸残基を有し、かつジオスミン及び２－メチルイソボルネオールからなる群より選択される少なくとも１種に応答性を有するポリペプチドである、請求項１～４のいずれか１項記載の方法。
TIFF
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【請求項６】
前記ＯＲ８Ｓ１と同等の機能を有するポリペプチドが、配列番号３で示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつジオスミン及び２－メチルイソボルネオールからなる群より選択される少なくとも１種に応答性を有するポリペプチドである、請求項１～３のいずれか１項記載の方法。
【請求項７】
前記嗅覚受容体ポリペプチドに試験物質を添加すること、及び
該試験物質に対する該嗅覚受容体ポリペプチドの応答を測定すること、
を含む、請求項１～６のいずれか１項記載の方法。
【請求項８】
前記試験物質に対する前記嗅覚受容体ポリペプチドの応答を増強する試験物質をカビ臭抑制剤として選択することをさらに含む、請求項７記載の方法。
【請求項９】
対照群における前記嗅覚受容体ポリペプチドの応答を測定することをさらに含む、請求項７記載の方法。
【請求項１０】
前記試験物質に対する前記嗅覚受容体ポリペプチドの応答を前記対照群と比べて増強する試験物質をカビ臭抑制剤として選択することをさらに含む、請求項９記載の方法。
（【請求項１１】以降は省略されています）
発明の詳細な説明【技術分野】
【０００１】
本発明はカビ臭を抑制する香料素材を探索する方法に関する。
続きを表示（約 3,800 文字）【背景技術】
【０００２】
食品、飲料水、空気調和装置（エアコン）のフィルター等、カビが生息することによって生じるカビ臭は、微弱な臭いであってもヒトに対して不快感を与える。
カビ臭は、放線菌、藍藻といった様々な微生物の増殖によって生成する物質の存在によって臭気を感じるものである。代表的な原因物質として、ジオスミン及び２－メチルイソボルネオールが知られている（非特許文献１及び２）。当該物質については、ビーツを由来とする食品、魚介類、果汁等の不快臭のみならず、水道水のカビ臭の原因ともなるため、我が国の水道法において、０．００００１ｍｇ／Ｌ以下と云う基準値が設定されている。ジオスミン及び２－メチルイソボルネオールの発生源には藍藻類、放線菌をはじめとする様々な微生物が知られているが共通しない発生源も多い。例えばカナダにおける水質調査の結果、藍藻類、放線菌の活動が低下する冬季において、ジオスミンが減少したものの２－メチルイソボルネオールは変わらずに検出され続けたことから、２－メチルイソボルネオールについて異なる発生源の存在が示唆されている（非特許文献３）。他の文献では、ストレプトマイセス属がジオスミンよりも顕著に２－メチルイソボルネオールを産生することが報告されている（非特許文献４）。
【０００３】
発生するカビ臭に対する対策として、カビ臭の原因となる微生物に対する抗菌成分を用いて静菌を行う技術、活性炭など発生したカビ臭の原因物質を取り除く技術、カビ臭よりも強い匂いの香料によりマスキングする技術等が提案されているが、このような技術は、発生したカビ臭成分を消臭するものではなく、カビ臭を根本的になくすことはできない。また、芳香剤の匂いによる不快感が生じることもある。
【０００４】
ヒト等の哺乳動物においては、匂いは、鼻腔上部の嗅上皮に存在する嗅神経細胞上の嗅覚受容体に匂い分子が結合し、それに対する受容体の応答が中枢神経系へと伝達されることにより認識されている。ヒトの場合、嗅覚受容体は約４００種存在することが報告されており、これらをコードする遺伝子はヒトの全遺伝子の約２％にあたる。一般的に、嗅覚受容体と匂い分子は複数対複数の組み合わせで対応付けられている。すなわち、個々の嗅覚受容体は構造の類似した複数の匂い分子を異なる親和性で受容し、一方で、個々の匂い分子は複数種の嗅覚受容体によって受容される。さらに、ある嗅覚受容体を活性化する匂い分子が、別の嗅覚受容体の活性化を阻害するアンタゴニストとして働くことも報告されている。これら複数種の嗅覚受容体の応答の組み合わせが、個々の匂いの認識をもたらしている。
【０００５】
従来、香料物質の開発においては、候補物質の匂いの評価は専門家による官能試験によって行われてきた。しかし、官能試験には、匂いを評価できる専門家の育成が必要なことや、スループット性が低いなどの問題があった。そこで近年では、候補物質に対する嗅覚受容体の応答を指標にした香料物質の探索方法が開発されている（特許文献１）。嗅覚受容体の応答は匂い物質に選択的であるため、最初に標的とする匂いに選択性を有する嗅覚受容体を見つけ出すことが肝要である。そうした嗅覚受容体を特定すれば、例えば悪臭の消臭を目的とする場合、アンタゴニストによる嗅覚受容体抑制又はアゴニストによる交差順応に基づくアプローチが可能となる。すなわち、悪臭であるカビ臭をより効果的に抑制することが可能となる。実際これまでに、カビ臭の原因物質であるジオスミンに応答する嗅覚受容体としてＯＲ１１Ａ１、２－メチルイソボルネオールに応答する嗅覚受容体としてＯＲ２Ｍ３（特許文献２）が、あるいはジオスミンに応答する嗅覚受容体としてＯＲ１１Ａ１、ＯＲ２Ｍ３及びＯＲ１Ａ１（特許文献３）が特定されている。しかし、既存の受容体解析方法では、全ヒト受容体の１２％程度しか機能解析に成功していない（非特許文献５）。このように、嗅覚システムは未だに解明されておらず、よって、分子生物学的アプローチにより特定の匂いに感受性がある嗅覚受容体を全て見出すことも容易でないという問題があった。
【０００６】
殆どの嗅覚受容体が解析に成功していない原因は、目的の嗅覚受容体ポリペプチドを培養細胞に作らせても、細胞の表面に移行（膜発現）せず、小胞体内に留まってしまうことにある。そのため、細胞外から投与するにおい物質に対する結合性を評価することができない。嗅覚受容体が膜発現しない原因については永らく未知であったが、近年、培養細胞で膜発現するマウス嗅覚受容体と膜発現しないマウス嗅覚受容体が比較解析された（非特許文献６）。その結果、膜発現しない嗅覚受容体は立体構造の安定性が低い可能性が見出された。そして重要なことに、膜発現可能な嗅覚受容体と不可能な嗅覚受容体との間にはタンパク質の一次アミノ酸配列において統計学上有意にＧｒａｎｔｈａｍｄｉｓｔａｎｃｅが異なるアミノ酸箇所が存在し、そのアミノ酸箇所とは、約一千種の全マウス嗅覚受容体において共通性の高いアミノ酸であることが示された。すなわち、膜発現しない嗅覚受容体とは、本来共通するアミノ酸が使われるべきポリペプチドの位置に、異なるアミノ酸への変異が起きたために、立体構造の安定性を欠き、培養細胞内で、細胞膜に移行させない判断が下されている可能性が示唆された。このことを踏まえると、嗅覚受容体間で共通性の高いアミノ酸を導入する「コンセンサス化法」によって、目的の嗅覚受容体を安定的なタンパク質として獲得することや、効率よく細胞膜上に発現させることが可能になると考えられる。
【０００７】
こうした考えのもと、非特許文献５では特定の嗅覚受容体を解析可能とするためにコンセンサス化法が用いられた。具体的には、ヒト嗅覚受容体ＯＲ６Ｙ１、ＯＲ６Ｂ２、ＯＲ５６Ａ４の３種類について、それぞれ１０種類の哺乳類（ゴリラ、ボノボ、チンパンジー、スマトラオランウータン、アカゲザル、ドリル、コモンマーモセット、ハイイロネズミキツネザル、ラット、マウス）の相同遺伝子間での共通性の高いアミノ酸を、それぞれのヒト嗅覚受容体に導入したコンセンサス嗅覚受容体ＯＲ６Ｙ１、ＯＲ６Ｂ２、ＯＲ５６Ａ４を作製した。その結果、３種の嗅覚受容体のうちＯＲ６Ｙ１は培養細胞を用いて匂い物質に対する応答測定を行うことが可能になったことが開示されている。したがって、コンセンサス化により応答解析が可能になる受容体は存在するものの、その割合は１／３程度であることが示唆されている。
【０００８】
コンセンサス化法は産業上有用な酵素を安定的なものにデザインするために古くから実施されてきた。しかし、本法に関する総説である非特許文献７によれば、ある一箇所のアミノ酸配列にコンセンサス化を導入して改善効果が得られる確率は５０％程度であり、残る４０％は逆にタンパク質を改悪してしまうリスクがあることが、コンセンサス化法の利用を難しくしていると指摘する。また、嗅覚受容体の本来の機能を推定することを目的とした研究においては、コンセンサス化方法の適用は適切ではないとする考え方がある。すなわち、アミノ酸置換を導入するアプローチには、オリジナル嗅覚受容体のリガンド結合部位を変化させ、その結果、本来のにおい応答性を観察させなくなる懸念がある。以上より、コンセンサス化には成功率の低さと、目的の嗅覚受容体本来の機能を変容させてしまうリスクの二つが予測されることから、幅広い嗅覚受容体に対する有効性が検証された例はなかった。
【０００９】
斯かる状況下、本発明者は、嗅覚受容体を培養細胞膜上に発現かつ機能させることができる手法について鋭意検討した結果、目的の嗅覚受容体のアミノ酸配列を、該目的の嗅覚受容体のアミノ酸配列と該目的の嗅覚受容体の特定のオルソログ又は特定のオルソログ及びパラログにコードされる嗅覚受容体のアミノ酸配列のアラインメントから従来とは異なる基準に従い導き出されるコンセンサスアミノ酸配列に基づいて改変することにより、改変された嗅覚受容体の培養細胞での膜発現をオリジナルの嗅覚受容体に比べて向上できること、改変された嗅覚受容体の匂い応答性をオリジナルの嗅覚受容体に比べて向上できること、また、改変された嗅覚受容体の培養細胞での膜発現がオリジナルの嗅覚受容体に比べて向上しない場合であっても改変された嗅覚受容体の匂い応答性を向上できること、さらに、改変された嗅覚受容体が改変前のオリジナルの嗅覚受容体のリガンド選択性をよく維持できること、改変された嗅覚受容体によりもたらされる解析結果はヒトの嗅覚をよく反映するものであることを見出した（特許文献４）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
特開２０１８－７４９４４号公報
特許第６１０４０４５８号公報
特表２０２１－５０４６７３号公報
特開２０２３－２４８４号公報
【非特許文献】
（【００１１】以降は省略されています）

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