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公開番号2024177515
公報種別公開特許公報(A)
公開日2024-12-19
出願番号2024176620,2022144599
出願日2024-10-08,2018-10-25
発明の名称卵における複製のための安定化されたHAを有する組換えインフルエンザウイルス
出願人ウィスコンシンアルムニリサーチファンデイション,国立大学法人東京大学
代理人個人,個人,個人,個人,個人
主分類C12N 7/01 20060101AFI20241212BHJP(生化学;ビール;酒精;ぶどう酒;酢;微生物学;酵素学;突然変異または遺伝子工学)
要約【課題】卵における増殖中のインフルエンザウイルスのヘマグルチニン(HA)セグメントにおける抗原性を損なう突然変異の獲得を妨げるインフルエンザ突然変異を提供すること。
【解決手段】本開示では、ウイルス複製能を向上させ、それによってワクチンウイルスの収量を向上させる改変インフルエンザノイラミニダーゼを開示する。インフルエンザウイルスによってそのように改変されたノイラミニダーゼの発現はまた、共発現されたヘマグルチニンを安定させ、ヘマグルチニンが突然変異を起こさないようにすることも可能である。
【選択図】図12
特許請求の範囲【請求項１】
複数の選択された残基をコードする選択されたＮＡウイルスセグメント又はＮＡにおける残基の欠失を含む単離された組換えインフルエンザウイルスであって、ここで、前記選択されたＮＡウイルスセグメントが、残基３２にスレオニンを有するＮＡをコードしない、１４７位にアスパラギン酸を有するＮＡをコードしない、１４８位にスレオニンを有するＮＡをコードしない、１５１位にアスパラギン酸を有するＮＡをコードしない、２４５位にアスパラギンを有するＮＡをコードしない、残基３２９にアスパラギンを有するＮＡをコードしない、３４６位にグリシンを有するＮＡをコードしない、残基３４７にヒスチジンを有するＮＡをコードしない、又は１つ以上の残基４６～５０の欠失を有するＮＡをコードする、又はそれら何れかの組み合わせであり、ここで、番号付けはＮ２に基づき、ここで、前記組換えインフルエンザウイルスは、鳥類の卵で複製能が増強されているか、又は鳥類の卵で増殖させた場合、残基３２にスレオニンをコードし、残基４６～５０の欠失を有せず、１４７位にアスパラギン酸をコードし、２４８位にスレオニンをコードし、残基１５１にアスパラギン酸をコードし、残基２４５にアスパラギンをコードし、残基３２９にアスパラギンをコードし、残基３４６にグリシンをコードし、残基３４７にヒスチジンをコードし、又はそれら何れかの組み合わせであるＮＡを有する対応するインフルエンザウイルスと比較してＨＡ突然変異が減少している、単離された組換えインフルエンザウイルス。
続きを表示（約 800 文字）【請求項２】
前記単離された組換えインフルエンザウイルスが、再集合体である、請求項１に記載の単離された組換えインフルエンザウイルス。
【請求項３】
前記ＮＡウイルスセグメントが、配列番号１、配列番号３、配列番号４８、配列番号４９、又は配列番号５０に対し、少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有するＮＡをコードする、請求項１又は２に記載の単離された組換えインフルエンザウイルス。
【請求項４】
前記ＮＡウイルスセグメントが、配列番号２に対し、少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有するＮＡをコードする、請求項１～３の何れか１項に記載の単離された組換えインフルエンザウイルス。
【請求項５】
前記ＮＡウイルスセグメントが、Ｎ２、Ｎ３、Ｎ７、又はＮ９をコードする、請求項１～４の何れか１項に記載の単離された組換えインフルエンザウイルス。
【請求項６】
前記ＮＡウイルスセグメントが、Ｎ１、Ｎ４、Ｎ５、Ｎ６、Ｎ８、Ｎ１０又はＮ１１をコードする、請求項１～５の何れか１項に記載の単離された組換えインフルエンザウイルス。
【請求項７】
前記３２位の残基が、Ａ、Ｉ、Ｇ、又はＬである、請求項１～６の何れか１項に記載の単離された組換えインフルエンザウイルス。
【請求項８】
前記欠失が、残基４６～５０の欠失である、請求項１～７の何れか１項に記載の単離された組換えインフルエンザウイルス。
【請求項９】
前記１４７位の残基が、Ｎ又はＱである、請求項１～８の何れか１項に記載の単離された組換えインフルエンザウイルス。
【請求項１０】
前記１４８位の残基が、Ｋ、Ｒ又はＨである、請求項１～９の何れか１項に記載の単離された組換えインフルエンザウイルス。
（【請求項１１】以降は省略されています）
発明の詳細な説明【技術分野】
【０００１】
関連する出願との相互参照
本願は、２０１７年１０月２５日に提出された米国出願６２／５７７，０４９、及び２０１８年２月２１日に提出された米国出願６２／６３３，４００の提出日の利益を主張し、それらを参照することによって本明細書に組み込まれる。
続きを表示（約 5,400 文字）【０００２】
政府資金の申告
本発明は、国立衛生研究所によって与えられたＨＨＳＯ１００２０１５０００３３Ｃに基づく政府の支援を受けて行われた。政府は、本発明に一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００３】
研究背景
インフルエンザは、ウマを含む一部の哺乳動物の主要な呼吸器疾患であり、毎年かなりの罹患率と経済的損失の原因となっている。加えて、インフルエンザウイルス感染は、いくつかの鳥類の種に深刻な全身性疾患を引き起こし、死に至らしめる可能性がある。インフルエンザウイルスゲノムのセグメント化された性質により、２つ以上のインフルエンザウイルスに感染した細胞におけるウイルス複製中のセグメントの再集合が可能になる。セグメントの再集合は、遺伝子突然変異及び遺伝的浮動と組み合わせて、時間の経過と共に無数の多様なインフルエンザウイルス系統を生じさせる可能性がある。新しい系統は、ヘマグルチニン（ＨＡ）及び／又はノイラミニダーゼ（ＮＡ）タンパク質に抗原変異を示し、特にＨＡタンパク質をコードする遺伝子は、変動率が高い。インフルエンザの予防のための主の現在の実践は、ワクチン接種である。最も一般的には、不活化ウイルスワクチンが使用される。インフルエンザＨＡタンパク質は、ウイルスに対する宿主の免疫防御応答の主要な標的抗原であり、非常に多様性に富み、インフルエンザウイルスの単離及び近年の流行に関連するウイルスのＨＡ抗原の同定及び特性評価は、ワクチンの製造にとって重要である。有病率及び予測に基づき、ワクチンは、優性でありかつ、予想されるインフルエンザウイルス系統に対する免疫防御応答を刺激するように設計されている。
【０００４】
インフルエンザウイルスは、Ａ型、Ｂ型、Ｃ型、及びＤ型の４つの一般的なタイプがあり、それらは、内部タンパク質間の血清学的交差反応がないことによって定義される。Ａ型インフルエンザウイルスは、それらの糖タンパク質、ＨＡ及びＮＡタンパク質の抗原的及び遺伝的違いに基づき、サブタイプにさらに分類される。既知の全てのＨＡ及びＮＡサブタイプ（Ｈ１～Ｈ１８及びＮ１～Ｎ１１）は、インフルエンザの天然の保有体として働くと思われる水鳥から単離されている。
【０００５】
ほとんどのインフルエンザワクチンは、孵化鶏卵で産生される。しかしながら、ＷＨＯ推奨のインフルエンザワクチン系統は、孵化鶏卵においては効率的に複製されないことが多く、ウイルスの適応のために卵の連続的な継代が必要である。卵の適応及び増幅中に、インフルエンザワクチンヘマグルチニン（ＨＡ）タンパク質は、多くの場合、卵適応突然変異を獲得する。ＨＡのこれらの卵適応突然変異は、多くの場合、ウイルスの抗原性を変化させ、その結果、流行しているウイルス系統に最適ではなくなったワクチンウイルスとなる。
【発明の概要】
【０００６】
本明細書に記載されているように、インフルエンザウイルスは、適応中に６つの非免疫原性ウイルスセグメントで発生した変異を研究するために、卵（３組）において７回継代された。驚くべきことに、ウイルスは、ＨＡ突然変異を獲得せず、代わりにＮＡ、ＰＢ２、ＮＰ及びＭ１タンパク質に突然変異を有した。ＮＡ突然変異は、３つの実験全てで同一であり、それらには、欠失及び４つのアミノ酸突然変異が含まれていた。ＮＡ突然変異は、単独で試験され、それらが、例えば単独又は様々な組み合わせで、ＨＡ突然変異を伴わない卵における効率的な増殖を可能にする効果の要因であることが分かった。
【０００７】
従って、本開示は、卵における増殖中のインフルエンザウイルスのヘマグルチニン（ＨＡ）セグメントにおける抗原性を損なう突然変異の獲得を妨げるインフルエンザ突然変異に関する。ヒトインフルエンザウイルスのノイラミニダーゼ（ＮＡ）タンパク質の突然変異は、卵の継代中にＨＡを「安定化」させること、例えば、ＮＡに突然変異が存在する場合、ＨＡタンパク質は、卵適応突然変異を獲得しないことが見出された。これらＮＡ突然変異はまた、ワクチンウイルスの収量を増加させる可能性がある。
【０００８】
本開示は、ＮＡにおける特定の位置で選択されたアミノ酸残基又は欠失を有する、単離された組換え体、例えば、再集合体インフルエンザウイルスを提供する。一実施形態において、ＮＡは、残基３２でスレオニンをコードしないように選択される。一実施形態において、ＮＡは、１４７位のアスパラギン酸をコードしないように選択される。一実施形態において、３２９位のアスパラギンをコードしないように選択される。一実施形態において、ＮＡは、残基３２９でスレオニンをコードしないように選択される。一実施形態において、ＮＡは、残基３４６でグリシンをコードしないように選択される。一実施形態において、ＮＡは、残基３４７でヒスチジンをコードしないように選択される。一実施形態において、ＮＡは、残基３４７のアルギニン又はアスパラギンをコードしないように選択される。一実施形態において、ＮＡは、１４８位でスレオニンを有するＮＡをコードしないように選択される。一実施形態において、ＮＡは、１５１位でアスパラギン酸を有するＮＡをコードしないように選択される。一実施形態において、ＮＡは、２４５位でアスパラギンを有するＮＡをコードしないように選択される。一実施形態において、ＮＡは、３４６位でグリシンを有するＮＡをコードしないように選択される。一実施形態において、ＮＡは、残基４６～５０の１つ以上の欠失を有するように選択される。ＮＡの番号付けは、Ｎ２に基づく。一実施形態において、本開示は、ワクチンインフルエンザウイルス、例えば、ＰＲ８ＵＷ、１つ以上の特定の位置で特定の残基又は特定の残基の欠失を有するＮＡウイルスセグメント、又はそれら何れかの組み合わせ、及びＨＡウイルスセグメント、例えば、流行しているインフルエンザウイルス由来のＨ１～Ｈ１８の何れかに由来する６個の「内部」ウイルスセグメントを有する単離組換え再集合体インフルエンザウイルスを提供する。組換えインフルエンザウイルスを含む組成物、ワクチン等の医薬組成物も提供される。
【０００９】
従って、細胞中、例えば卵中で増殖又は継代されるワクチンウイルスについて、３２、１４７、３２９、３４７位の残基での置換、又は1つ以上の４６～５０残基の欠失、又はそれら何れかの組み合わせ、ＮＡにおいて、例えば、突然変異によって、又はＮＡが残基３２でスレオニンをコードしないように、１４７位でアスパラギン酸コードしないように、３２９位でアスパラギンをコードしないように、３４７位でヒスチジンをコードしないように、又は1つ以上の４６～５０残基の欠失を有するように、又はそれら何れかの組み合わせは、ＨＡの安定化及び／又はより高いウイルス力価をもたらし得、ここで、上記番号付けはＮ２に基づく。一実施形態において、細胞中、例えば卵中で増殖又は継代されるワクチンウイルスについて、１４８、１５１、２４５、３４６位で残基の置換、又はそれら何れかの組み合わせ、ＮＡにおいて、例えば、突然変異によって、又はＮＡが、残基１４８でスレオニンをコードしないように、１５１位でアスパラギン酸をコードしないように、残基２４５でアスパラギンをコードしないように、残基３４６でグリシンをコードしないように、又はそれら何れかの組み合わせの選択されたＮＡウイルスセグメントは、ＨＡの安定化及び／又はより高いウイルス力価をもたらし得、ここで、上記番号付けはＮ２に基づく。
【００１０】
一実施形態において、本開示は、ＰＡ、ＰＢ１、ＰＢ２、ＮＰ、ＮＳ、Ｍ及びＨＡウイルスセグメント及び３２残基でスレオニンをコードしないように、１４７位でアスパラギン酸をコードしないように、残基３２９でアスパラギンをコードしないように、残基３４７でヒスチジンをコードしないように、又は１つ以上の４６～５０残基の欠失を有しないように、又はそれら何れかの組み合わせから選択されたＮＡをコードするＮＡウイルスセグメント、ここで、上記番号付けはＮ２に基づく、を含む単離組換えインフルエンザウイルスを提供し、ここで、当該組換えインフルエンザウイルスは、鳥類の卵中で強化された複製能を有するか又は鳥類の卵で増殖した際、残基３２でスレオニンをコードし、残基４６～５０の欠失を有せず、１４７位でアスパラギン酸をコードし、残基３２９でアスパラギンをコードし、残基３４７でヒスチジンをコードする、又はそれら何れかの組み合わせのＮＡを有する対応するインフルエンザウイルスと比較してＨＡ突然変異が減少している。一実施形態において、本開示は、ＰＡ、ＰＢ１、ＰＢ２、ＮＰ、ＮＳ、Ｍ及びＨＡウイルスセグメント及び残基１４８でスレオニンをコードしない、１５１位でアスパラギン酸をコードしない、残基２４５でアスパラギンをコードしない、残基３４６でグリシンをコードしない、又はそれら何れかの組み合わせの選択されたＮＡウイルスセグメントを含む単離組換えインフルエンザウイルスを提供し、ここで、上記番号付けは、Ｎ２に基づき、当該組換えインフルエンザウイルスは、鳥類の卵中で強化された複製能を有するか又は鳥類の卵で増殖した際、残基１４８でスレオニンをコードし、１５１位でアスパラギン酸をコードし、残基２４５でアスパラギンをコードし、残基３４６でグリシンをコードし、又はそれら何れかの組み合わせのＮＡを有する対応するインフルエンザウイルスと比較してＨＡ突然変異が減少している。一実施形態において、単離組換えインフルエンザウイルスは、再集合体である。一実施形態において、ＮＡウイルスセグメントは、配列番号１～３、３０～３８、４８～５０、又は５４の何れか１つと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、又は９９％のアミノ酸配列同一性を有するＮＡをコードする。一実施形態において、ＮＡウイルスセグメントは、配列番号２又は配列番号３と１００％未満のアミノ酸配列同一性を有するＮＡをコードする。一実施形態において、ＮＡウイルスセグメントは、Ｎ２、Ｎ３、Ｎ７、又はＮ９をコードし、及び特定の残基を有するＮ３、Ｎ７、又はＮ９の位置は、Ｎ２の特定の位置に相当する。一実施形態において、ＮＡウイルスセグメントは、Ｎ１、Ｎ４、Ｎ５、Ｎ６、Ｎ８、Ｎ１０又はＮ１１をコードし、特定の残基を有するＮ１、Ｎ４、Ｎ５、Ｎ６、Ｎ８、Ｎ１０又はＮ１１の位置は、Ｎ２の特定の位置に相当する。一実施形態において、３２位の残基は、Ａ、Ｉ、Ｇ、又はＬである。一実施形態において、欠失は、残基４６～５０の欠失である。一実施形態において、１４７位の残基は、Ｎ又はＱである。一実施形態において、３２９位の残基は、Ｄ又はＥである。一実施形態において、３４７位の残基は、Ｑ、Ｎ、Ｓ、Ｔ、Ｙ、Ｃ又はＷである。一実施形態において、ＨＡは、Ｈ１、Ｈ３、Ｈ７、又はＨ９である。一実施形態において、ウイルスは、Ａ型インフルエンザウイルスである。一実施形態において、ＰＡ、ＰＢ１、ＰＢ２、ＮＰ、Ｍ及びＮＳウイルスセグメントは、配列番号２４～２９と少なくとも８５％の核酸配列同一性を有するか、又は配列番号２４～２９又は３９～４４によってコードされるポリペプチドに対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、又は９９％のアミノ酸配列同一性を有するポリペプチドをコードする。一実施形態において、ＰＢ２は、残基１４７でＩ、Ａ、Ｌ、又はＧを有する。一実施形態において、ウイルスは、Ｂ型インフルエンザウイルスである。一実施形態において、選択されたＮＡウイルスセグメントは、１４７位でアスパラギン酸を有せず、残基３２９でアスパラギンを有せず、及び残基３４７でアルギニン又はヒスチジン有しない。一実施形態において、選択されたＮＡウイルスセグメントは、１４８位にスレオニンを有せず、１５１位にアスパラギン酸を有せず、２４５位にアスパラギンを有しない。一実施形態において、選択されたＮＡウイルスセグメントは、１４７位でＮ又はＱ、残基３２９でＤ又はＥ、又は残基３４７でＱ又はＧの少なくとも２つを有する。一実施形態において、選択されたＮＡウイルスセグメントは、１４８位でＫ、Ｒ又はＨ、１５１位でＥ又はＱ、又は２４５位でＳ、Ｉ、Ｔ、Ｖ又はＧの少なくとも２つを有する。一実施形態において、選択されたＮＡウイルスセグメントは、１４７位でＮ又はＱ、残基３２９Ｄ又はＥ、及び残基３４７でＱ又はＧを有する。一実施形態において、選択されたＮＡウイルスセグメントは、１４７位にＮ又はＱ、残基３２９でＤ又はＥ、及び残基３４６でＶ、Ｓ、Ｉ又はＬを有する。一実施形態において、選択されたＮＡウイルスセグメントは、１４８位でＫ、Ｒ又はＨ、１５１位でＥ又はＱ、及び２４５位でＳ、Ｉ、Ｔ、Ｖ又はＧを有する。
（【００１１】以降は省略されています）

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