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公開番号2024156656
公報種別公開特許公報(A)
公開日2024-11-06
出願番号2024102884,2020570748
出願日2024-06-26,2019-06-21
発明の名称キメラ増殖因子受容体
出願人インスティルバイオ (ユーケイ) リミテッド
代理人個人,個人,個人,個人,個人,個人
主分類C12N 5/16 20060101AFI20241029BHJP(生化学;ビール;酒精;ぶどう酒;酢;微生物学;酵素学;突然変異または遺伝子工学)
要約【課題】トロンボポエチン融合受容体などのキメラ増殖因子受容体を発現するように操作されているT細胞および他のリンパ球を提供する。また、養子細胞療法におけるこれらの細胞の使用を提供する。
【解決手段】増殖スイッチとして機能し得るトロンボポエチン(Tpo)受容体をベースとしたキメラ組換え増殖因子受容体(CrGFR)を含むT細胞およびNK細胞を含むリンパ球を操作により作製することにより、受容体へのCrGFRリガンドの結合後に、操作されたリンパ球の増殖を誘導する。
【選択図】図1
特許請求の範囲【請求項１】
（ｉ）細胞外（ＥＣ）ドメイン；
（ｉｉ）トロンボポエチン膜貫通（ＴＭ）ドメイン；および
（ｉｉｉ）第１の細胞内（ＩＣ）ドメイン；および任意に、
（ｉｖ）第２の細胞内ドメイン
を含むキメラ組換え増殖因子受容体（ＣｒＧＦＲ）を含むＴ細胞またはＮＫ細胞。
続きを表示（約 980 文字）【請求項２】
リガンドのＣｒＧＦＲへの結合がＴ細胞またはＮＫ細胞の増殖を誘導する、請求項１に記載のＴ細胞またはＮＫ細胞。
【請求項３】
リガンドがヒトトロンボポエチン、トロンボポエチン受容体アゴニスト、または腫瘍関連抗原である、請求項２に記載のＴ細胞またはＮＫ細胞。
【請求項４】
トロンボポエチン受容体アゴニストがＴＭドメインに結合する、請求項３に記載のＴ細胞またはＮＫ細胞。
【請求項５】
トロンボポエチン受容体アゴニストがエルトロンボパグおよびロミプロスチムから選択される、請求項３または請求項４に記載のＴ細胞またはＮＫ細胞。
【請求項６】
ＥＣドメインがヒトｃ－ｍｐｌ（トロンボポエチン）ＥＣドメインを含む、請求項１～５のいずれか１項に記載のＴ細胞またはＮＫ細胞。
【請求項７】
ＥＣドメインが、ｉ）切断型ＥＣドメイン、ｉｉ）切断型ｃ－ｍｐｌＥＣドメイン、ｉｉｉ）腫瘍関連抗原に結合するドメイン、ｉｖ）腫瘍関連抗原に結合する抗体もしくは抗体フラグメント；およびｖ）選択マーカーのうちの１つまたは複数を含む、請求項１～５のいずれか１項に記載のＴ細胞またはＮＫ細胞。
【請求項８】
第１のＩＣドメインがヒト成長ホルモン受容体、ヒトプロラクチン受容体、ヒトトロンボポエチン受容体（ｃ－ｍｐｌ）、Ｇ－ＣＳＦ受容体、ＧＭ－ＣＳＦ受容体、ＬＭＰ、ＩＬ２、ＣＤ２８またはＣＤ１３７から選択される、請求項１～７のいずれか１項に記載のＴ細胞またはＮＫ細胞。
【請求項９】
第１のＩＣドメインがヒトトロンボポエチン受容体（ｃ－ｍｐｌ）由来のＩＣドメイン、またはヒトトロンボポエチン受容体（ｃ－ｍｐｌ）由来の切断型ＩＣドメインを含む、請求項１～８のいずれか１項に記載のＴ細胞またはＮＫ細胞。
【請求項１０】
第２のＩＣドメインが、ヒト成長ホルモン受容体、ヒトプロラクチン受容体、ヒトトロンボポエチン受容体（ｃ－ｍｐｌ）、Ｇ－ＣＳＦ受容体もしくはＧＭ－ＣＳＦ受容体、共刺激受容体、サイトカイン受容体または共シグナル伝達受容体由来である、請求項１～９のいずれか１項に記載のＴ細胞またはＮＫ細胞。
（【請求項１１】以降は省略されています）
発明の詳細な説明【技術分野】
【０００１】
がん退縮の媒介に自己Ｔ細胞を使用する養子細胞療法（ＡＣＴ）は、初期の臨床試験において非常に有望であることが明らかになっている。いくつかの一般的なアプローチ、例えば、天然に存在する腫瘍反応性の、またはｅｘｖｉｖｏで増殖された腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の使用などが取られてきた。さらに、Ｔ細胞は、所定の腫瘍抗原に向けてそれらを再標的化するために遺伝的に改変され得る。これは、ペプチド（ｐ）－主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）特異的Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）の遺伝子導入、または腫瘍特異的単鎖抗体フラグメント（ｓｃＦｖ）とＴ細胞シグナル伝達ドメイン（例えばＣＤ３ζ）の間の合成融合によって実施することができるが、後者はキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）と呼ばれている。ＴＩＬおよびＴＣＲの導入は、メラノーマを標的とする場合に特に良好であることが分かっており（Rosenberg et al. 2011；Morgan 2006）、一方、ＣＡＲ療法は特定のＢ細胞悪性腫瘍の治療において非常に有望であることが明らかになっている（Grupp et al. 2013）。
続きを表示（約 6,600 文字）【０００２】
ＡＣＴに関する現在の一般的な治療プロトコルは、ｅｘｖｉｖｏ増殖細胞を再注入する前に患者の循環リンパ球の大部分を除去する、シクロホスファミドおよび／またはフルダラビンを使用した初期非骨髄破壊的プレコンディショニング治療を行うことが必要である。これによって新しい細胞が増殖するための余地を得ることができ、正常細胞が新たに注入された細胞と増殖および生存シグナルを競合する「サイトカインシンク（ｃｙｔｏｋｉｎｅｓｉｎｋ）」が一掃される。細胞と一緒に、患者は、新しい細胞の移植および増殖を促進する高用量のインターロイキン（ＩＬ）－２の注入を介してサイトカインサポートを受ける。
現在、Ｔ細胞ＡＣＴの技術を制限している要因が多数存在する。上記の現在のプレコンディショニング療法には入院が必要であり、患者を免疫無防備状態のままにする可能性がある。さらに、多くの患者は、この治療レジメンの過酷さに耐えることができるほど十分な健康な状態ではない。プレコンディショニングを経てもさらに、支持療法としてのＩＬ－２の使用が、重度の毒性および集中治療処置の可能性と関わっている。実際、ＴＩＬ療法それ自体は、ＴＣＲおよびＣＡＲ療法と異なり、いかなる重大なオンまたはオフターゲット毒性とは関係しておらず、大部分の毒性事象は付随するＩＬ－２注入に関係している。
プレコンディショニングとＩＬ－２支持療法を最小限にするか、低減することができる方法には、次のような点で大きな利点がある：（ｉ）患者の入院を短縮する、（ｉｉ）ＡＣＴによって治療することができる可能性のある患者の割合を増やす、（ｉｉｉ）大がかりな入院に伴う臨床コストを削減することにより、多くの患者に対してＡＣＴの可能性をより開く。
したがって、プレコンディショニング治療および／またはＩＬ－２支持療法の必要性を最小限にする新しいＡＣＴ療法が求められている。
【０００３】
本発明は、臨床的に検証された薬物であり得るＣｒＧＦＲのリガンドを投与することによってオンまたはオフにすることができる組換えキメラ増殖因子受容体を発現する細胞を使用する。これにより、他の細胞に対する毒性は最小限にしてｉｎ－ｖｉｖｏで標的細胞を増殖させることが可能となる。
多くの報告書は、細胞のある特定の集団を増殖させる手段として、または抗体操作方策のための選択方法の開発のために増殖因子受容体操作のアイデアを使用している。例えば、多数の報告では、抗体－ＴｐｏＲまたはＥｐｏＲ融合が多くのバイオテクノロジー方策、例えば単鎖抗体選択などに使用され得ることが証明されており（Ueda et al. 2000、Kawahara et. Al. 2004）、また多くの報告では、増殖因子受容体融合が巨核球細胞株Ｂａ／Ｆ３および／または造血幹細胞を良好に増殖させることができることを証明している（Jin et al. 2000；Richard et al. 2000；Nagashima et al. 2003；Kawahara et al 2011；Saka et al. 2013）。
【０００４】
トロンボポエチン（Ｔｐｏ）受容体（ＴｐｏＲ；ＣＤ１１０、ｃ－ｍｐｌ）は、通常、巨核球系統の細胞において発現される。その通常の状態において、ＴｐｏＲはトロンボポエチンに応答してスイッチがオンになり、血小板の巨核球産生を引き起こす。ＴｐｏＲの血小板発現をシンクとして使用してＴｐｏの循環レベルを低下させることができる活性のネガティブフィードバックループ（ｎｅｇａｔｉｖｅｆｅｅｄｂａｃｋｌｏｏｐ）もある。重要なことには、ＴｐｏＲは、他のいずれの正常組織またはがん細胞でも発現されない（Columbyova 1995）。
【０００５】
最近の報告で、Ｔ細胞を野生型ＴｐｏＲで操作し、Ｔｐｏまたはエルトロンボパグ（Ｅｌｔｒｏｍｂｏｐａｇ）の投与を介してＴ細胞の生存および増殖を制御することができることが証明された（Nishimura et al. 2018）。しかし、トロンボポエチン融合受容体などのキメラ増殖因子受容体を発現するように操作されているＴ細胞および他のリンパ球の報告はなく、またＡＣＴにおけるこれらの細胞の使用の報告はない。
【図面の簡単な説明】
【０００６】
増殖因子ドメインを含むキメラ組換え増殖因子受容体の概略図である。これらの受容体は、ＴｐｏＲ細胞外ドメインと原形質膜にまたがる膜貫通ドメインからなる。細胞内ドメインは、受容体の全体的な活性を増大し、図の凡例で詳述されているように増殖因子ドメイン、共シグナル伝達ドメイン、または共刺激ドメインの選択に由来し得る１つまたは複数の追加ドメインに融合されたＴｐｏＲ細胞質ドメインからなる。Δ６０＝６０アミノ酸のＣ末端が欠失したＴｐｏＲ、ＩＬ２ｒβｃｙｔ＝ＩＬ２受容体ベータ鎖の細胞質ドメイン、ＳＬＡＭ＝ＳＬＡＭ／ＣＤ１５０、ＴＩＡＦ１＝ＴＧＦβ１誘導性抗アポトーシス因子１、ＴＬＲ１＝Ｔｏｌｌ様受容体１、ＣＤ４０＝ＣＤ４０／ＴＮＦＲＳＦ５、ＩＬ２ｒγ＝ＩＬ－２受容体共通ガンマ鎖、ＩＴＡＭ１＝ＣＤ３ζ由来の免疫受容体チロシンベース活性化モチーフ、ＬＭＰ１＝エプスタインバーウイルス潜在膜タンパク質１。
共刺激ドメインを含むキメラ組換え増殖因子受容体の概略図である。これらの受容体は、ＴｐｏＲ細胞外ドメインと原形質膜にまたがる膜貫通ドメインからなる。細胞内ドメインは、定義した共刺激受容体、例えば、限定するものではないがＣＤ２８またはＣＤ１３７などから得られる共刺激ドメインからなる。
レンチウイルス導入遺伝子の遺伝子構成の概略図である。ＴｐｏＲ導入遺伝子はコドン最適化され、ｐＳＦ．ＬｅｎｔｉレンチウイルスベクターのＸｂａＩおよびＮｈｅＩ制限消化対によってＥＦ１αプロモーターの下流にクローニングされた。
ＪｕｒｋａｔＥ６．１細胞における非形質導入の野生型（ＷＴ）およびバリアントのキメラ組換え増殖因子受容体のフロー分析を示す図である。ＪｕｒｋａｔＥ６．１Ｔ細胞に、示した導入遺伝子を有するレンチウイルス粒子を形質導入した。発現は、抗ＣＤ１１０－ＰＥ抗体を使用して感染の７２時間後に評価した。
Ｂａ／Ｆ３細胞におけるキメラ組換え増殖因子受容体活性の分析を示す図である。サイトカイン依存性マウスＢ細胞株Ｂａ／Ｆ３に示したＣｒＧＦＲを形質導入し、ＩＬ－３またはエルトロンボパグのいずれかと１０日間インキュベートした。ＣｒＧＦＲの発現は、ＣＤ１１０抗体を使用し、示した時点でフローサイトメトリーにより評価した。
ドナー１由来の一次ヒトＴ細胞に対するエルトロンボパグおよびＩＬ－２の分析を示す図である。ドナー１由来の一次ヒトＴ細胞にＷＴＴｐｏＲまたはバリアントＣｒＧＦＲを形質導入し、ＩＬ２またはエルトロンボパグの存在下でインキュベートした。細胞を２１日までの時点で取り出し、受容体を発現する細胞の割合を、ＰＥ結合型抗ＣＤ１１０抗体およびＭＡＣＳＱｕａｎｔアナライザーを使用して評価した。
ドナー２由来の一次ヒトＴ細胞に対するエルトロンボパグおよびＩＬ－２の分析を示す図である。ドナー２由来の一次ヒトＴ細胞にＷＴＴｐｏＲまたはバリアントＣｒＧＦＲを形質導入し、ＩＬ２またはエルトロンボパグの存在下でインキュベートした。細胞を２１日までの時点で取り出し、受容体を発現する細胞の割合を、ＰＥ結合型抗ＣＤ１１０抗体およびＭＡＣＳＱｕａｎｔアナライザーを使用して評価した。
ドナー３由来の一次ヒトＴ細胞に対するエルトロンボパグおよびＩＬ－２の分析を示す図である。ドナー３由来の一次ヒトＴ細胞にＷＴＴｐｏＲまたはバリアントＣｒＧＦＲを形質導入し、ＩＬ２またはエルトロンボパグの存在下でインキュベートした。細胞を２１日までの時点で取り出し、受容体を発現する細胞の割合を、ＰＥ結合型抗ＣＤ１１０抗体およびＭＡＣＳＱｕａｎｔアナライザーを使用して評価した。
次の分析ラウンドに最適なＣｒＧＦＲの選択を示す図である。エルトロンボパグで２１日間インキュベーションした後の３名のドナーの一次ヒトＴ細胞におけるＣｒＧＦＲの発現を示すフローサイトメトリープロット。受容体のＴｐｏＲ．ＣＤ４０、ＴｐｏＲ．ＩＬ２ｒγ、ＴｐｏＲ．ＩＴＡＭ１、ＴｐｏＲ．Δ６０、ＴｐｏＲ．ＬＭＰ１－ｃｙｔｏおよびＴｐｏＲ．ＴｐｏＲ－ｃｙｔｏ．ＬＭＰ１－ｃｙｔｏを、今後のｗｔＴｐｏＲとの比較のために選択した。
ドナー４由来のＣｒＧＦＲ選別一次ヒトＴ細胞に対するエルトロンボパグおよびＩＬ－２の分析を示す図である。ドナー４由来の一次ヒトＴ細胞にＷＴＴｐｏＲまたはバリアントＣｒＧＦＲを形質導入し、ＩＬ２またはエルトロンボパグについて選択され、ＩＬ２またはエルトロンボパグの存在下でインキュベートされるＭｉｌｔｅｎｙｉＭＡＣＳ技術により発現を濃縮した。細胞を７日までの時点で取り出し、受容体を発現する細胞の数を、ＰＥ結合型抗ＣＤ１１０抗体、ＤＲＡＱ７生存率用色素、およびＭＡＣＳＱｕａｎｔアナライザーを使用して評価した。
ドナー５由来のＣｒＧＦＲ選別一次ヒトＴ細胞に対するエルトロンボパグおよびＩＬ－２の分析を示す図である。ドナー５由来の一次ヒトＴ細胞にＷＴＴｐｏＲまたはバリアントＣｒＧＦＲを形質導入し、ＩＬ２またはエルトロンボパグについて選択され、ＩＬ２またはエルトロンボパグの存在下でインキュベートされるＭｉｌｔｅｎｙｉＭＡＣＳ技術により発現を濃縮した。細胞を７日までの時点で取り出し、受容体を発現する細胞の数を、ＰＥ結合型抗ＣＤ１１０抗体、ＤＲＡＱ７生存率用色素、およびＭＡＣＳＱｕａｎｔアナライザーを使用して評価した。
ドナー６由来のＣｒＧＦＲ選別一次ヒトＴ細胞におけるエルトロンボパグおよびＩＬ－２の分析を示す図である。ドナー６由来の一次ヒトＴ細胞にＷＴＴｐｏＲまたはバリアントＣｒＧＦＲを形質導入し、ＩＬ２またはエルトロンボパグについて選択され、ＩＬ２またはエルトロンボパグの存在下でインキュベートされるＭｉｌｔｅｎｙｉＭＡＣＳ技術により発現を濃縮した。細胞を７日までの時点で取り出し、受容体を発現する細胞の数を、ＰＥ結合型抗ＣＤ１１０抗体、ＤＲＡＱ７生存率用色素、およびＭＡＣＳＱｕａｎｔアナライザーを使用して評価した。
ＴＩＬ０４２のキメラ組換え増殖因子受容体の分析を示す図である。ＴＩＬ０４２由来の腫瘍浸潤リンパ球にＷＴＴｐｏＲまたは示したバリアントＣｒＧＦＲを形質導入し、患者に適合した腫瘍株の存在下で、ＩＬ２、エルトロンボパグ、ＩＬ－２＋エルトロンボパグを添加して、または増殖因子を添加しないでインキュベートした。細胞を４日目および７日目に分析およびカウントし、受容体を発現する細胞の数を、ＰＥ結合型抗ＣＤ１１０抗体、ＤＲＡＱ７生存率用色素、およびＭＡＣＳＱｕａｎｔアナライザーを使用して評価した。グラフは、ＴＩＬの回復が、腫瘍調節因子および／または活性化誘導細胞死によって引き起こされる数の最初の減少後に起こる場合の４日目～７日目のカウントを示す。
卵巣ＴＩＬにおけるキメラ組換え増殖因子受容体の分析を示す図である。３つの卵巣ＴＩＬ由来の腫瘍浸潤リンパ球にＷＴＴｐｏＲまたは示したバリアントＣｒＧＦＲを形質導入し、患者に適合した腫瘍細胞の存在下で、エルトロンボパグと共に、または増殖因子なしでインキュベートした。細胞を４日目および７日目に分析およびカウントし、受容体を発現する細胞の数を、ＰＥ結合型抗ＣＤ１１０抗体、ＤＲＡＱ７生存率用色素、およびＭＡＣＳＱｕａｎｔアナライザーを使用して評価した。グラフは、ＴＩＬの回復が、腫瘍調節因子および／または活性化誘導細胞死によって引き起こされる数の最初の減少後に起こる場合の４日目～７日目のカウントを示す。
キメラ組換え増殖因子受容体によるｐＳＴＡＴの誘導を示す図である。一次ヒトＴ細胞を単離し、示したＣｒＧＦＲを形質導入した。細胞を、ＭｉｌｔｅｎｙｉＭＡＣＳ技術を使用してＣｒＧＦＲ発現について濃縮し、ポリクローナル刺激によって増殖させた。濃縮した細胞を、培地単独（ＲＰＭＩ）、ＩＬ２、ＩＬ１２、Ｔｐｏ、またはエルトロンボパグ（Ｅｌｔ）のいずれかで４時間刺激し、その後、メタノール固定およびホスホ－ＳＴＡＴ５に向けての抗体による細胞内染色を行った。
【発明の概要】
【０００７】
本発明者らは、増殖スイッチとして機能し得るＣｒＧＦＲを含むＴ細胞およびＮＫ細胞を含むリンパ球を操作により作製することができることを明らかにした。これによって、ＣｒＧＦＲリガンドを患者に投与することによりリンパ球をｉｎ－ｖｉｖｏで増殖させることができるようになる。本発明者らは、例えば、トロンボポエチン（Ｔｐｏ）受容体（ＴｐｏＲ；ＣＤ１１０、ｃ－ｍｐｌ）をベースとしたＣｒＧＦＲが、受容体へのＣｒＧＦＲリガンドの結合後に、操作されたリンパ球の増殖を誘導することを明らかにした。したがって、リガンドは、ＣｒＧＦＲを発現する細胞の増殖または活性化誘導性細胞死からの保護をもたらすが、患者における他の細胞における受容体の欠如または低発現に起因して、毒性は低いと予想される。ＴｐｏＲまたは他の関連する増殖因子受容体をベースとしたＣｒＧＦＲは、養子細胞療法において、ｉｎｖｉｔｒｏおよびｉｎｖｉｖｏでリンパ球増殖を増大させる有益なツールとなり得る。
【０００８】
したがって、第１の態様では、本発明は、
（ｉ）細胞外（ＥＣ）ドメイン；
（ｉｉ）トロンボポエチン膜貫通（ＴＭ）ドメイン；および
（ｉｉｉ）第１の細胞内（ＩＣ）ドメイン、および任意に、
（ｉｖ）第２の細胞内ドメイン
を含むキメラ組換え増殖因子受容体（ＣｒＧＦＲ）を含むＴ細胞またはＮＫ細胞を含むリンパ球を提供する。
【０００９】
ＣｒＧＦＲは、受容体リガンドがＣｒＧＦＲに結合することにより、受容体の活性化および細胞への増殖シグナル伝達が生じ、増殖および／または生存が誘導されるように設計されている。
リガンドは、ヒトトロンボポエチン、またはトロンボポエチン受容体アゴニスト、例えば、エルトロンボパグ、ルストロンボパグ（Ｌｕｓｏｔｒｏｍｂｏｐａｇ）、アバトロンボパグ（Ａｖａｔｒｏｍｂｏｐａｇ）またはロミプロスチム（Ｒｏｍｉｐｌａｓｔｉｍ）であり得る。
【００１０】
ＥＣドメインは、ヒトｃ－ｍｐｌＥＣドメイン（ヒトＴｐｏに結合する）であり得るか、またはｉ）切断型ＥＣドメイン、ｉｉ）切断型ｃ－ｍｐｌＥＣドメイン、ｉｉｉ）選択マーカー、例えばＣＤ３４のうちの１つもしくは複数であり得る。
ＣｒＧＦＲのＩＣドメインは、ＪＡＫ結合ドメインを含み得る。ＩＣドメインは、２つ以上の増殖因子受容体または他のシグナル伝達ドメインからなり、１つはヒト成長ホルモン受容体、ヒトプロラクチン受容体またはヒトトロンボポエチン受容体（ｃ－ｍｐｌ）のリストからのものであり得、追加の増殖因子または他のシグナル伝達ドメインはサイトカイン受容体シグナル伝達ドメイン（例えばＩＬ２受容体）、共シグナル伝達ドメイン（例えばＣＤ４０）、ウイルス発がん性タンパク質（例えばＬＭＰ１）、共刺激ドメイン（例えばＣＤ２８、ＣＤ１３７、ＣＤ１５０など）または他のマイトジェンドメイン（例えば、Ｔｏｌｌ様受容体、免疫受容体チロシンベース活性化モチーフ、ＣＤ３シグナル伝達ドメインなど）のリストからのもの（ただし限定するものではない）であり得るとからなる。
（【００１１】以降は省略されています）

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