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公開番号2024126026
公報種別公開特許公報(A)
公開日2024-09-19
出願番号2024090584,2020560893
出願日2024-06-04,2019-04-05
発明の名称早期発症型孤発性パーキンソン病の分子シグネチャの診断及び薬物スクリーニング
出願人シーダーズ-サイナイメディカルセンター
代理人個人,個人,個人,個人,個人,個人,個人,個人,個人,個人,個人,個人,個人,個人
主分類C12Q 1/02 20060101AFI20240911BHJP(生化学;ビール;酒精;ぶどう酒;酢;微生物学;酵素学;突然変異または遺伝子工学)
要約【課題】パーキンソン病をモデル化及び治療するための組成物及び方法を提供する。
【解決手段】パーキンソン病(PD)患者由来の人工多能性幹細胞(iPSC)をドーパミン作動性(DA)神経運命に向けて分化させることにより、これらの細胞が、PD患者の黒質で著しく変性することが観察されるDAニューロンの分子的及び機能的特性をインビトロで呈することが明らかになった。他の関連する細胞型の生成を駆動する臨床症状も、PDを有する患者のための新しい治療手段につながる可能性のある、インビトロでの新規のPD特異的表現型をもたらし得る。これらの患者からの分化した神経組織は、患者らの早期発症及び非家族性起源に起因して、ニューロンサブタイプ特異的な病態形成機序を発見するため、また重要なことに、PDへの感受性における患者らの遺伝的背景の寄与を調査するための重要な機会を提供する。
【選択図】図7
特許請求の範囲【請求項１】
化合物のスクリーニング方法であって、
ある量のニューロンを１つ以上の試験化合物と接触させること、
１つ以上のパラメータを測定すること、及び
測定された前記１つ以上のパラメータに基づいて１つ以上の試験化合物を選択すること
を含み、前記ニューロンが、血球由来の人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）から分化したものである、前記方法。
続きを表示（約 790 文字）【請求項２】
前記ニューロンが中脳ニューロンである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記中脳ニューロンがドーパミン作動性ニューロンである、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記１つ以上のパラメータがＰＫＣ活性化を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記１つ以上のパラメータが、ＴＦＥＢ活性化及びＺＫＳＣＡＮ３不活性化のうちの少なくとも一方を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記１つ以上のパラメータがα－シヌクレインタンパク質レベルを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記１つ以上のパラメータが、ＬＡＭＰ１、ＧＣａｓｅ、チロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）、及びドーパミンの活性のうちの少なくとも１つを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記１つ以上のパラメータが、ＬＡＭＰ、ＧＣａｓｅ、チロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）、及びドーパミンの発現レベルのうちの少なくとも１つを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記血球由来のｉＰＳＣが、
ある量の血球を、再プログラミング因子をコードする１つ以上のｏｒｉＰ／ＥＢＮＡ１ベクターと接触させること、
ある量の再プログラミング因子を前記血球内に送達すること、及び
前記血球を再プログラミング培地中で培養すること
を含む方法によって作製され、前記再プログラミング因子の送達及び再プログラミング培地中での培養によって血球由来のｉＰＳＣが生成される、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記ある量の血球が、神経変性疾患に罹患しているヒト対象から得られる、請求項９に記載の方法。
（【請求項１１】以降は省略されています）
発明の詳細な説明【技術分野】
【０００１】
連邦政府支援の研究に関する声明文
本発明は、ＮａｔｉｏｎａｌＩｎｓｔｉｔｕｔｅｓｏｆＨｅａｌｔｈから授与されたＮＳ１０５７０３のもと、政府の支援を受けて行われた。政府は、本発明に一定の権利を有する。
続きを表示（約 6,800 文字）【０００２】
発明の分野
パーキンソン病に関連するものを含む中脳ニューロンの生成に関連する方法及び組成物が本明細書に記載されている。
【背景技術】
【０００３】
背景
パーキンソン病（ＰＤ）は、二番目に多く診断される神経変性疾患であり、現在の老齢人口の間で相当な経済的負担となっている。ＰＤにおける古典的に関連付けられる病理は、黒質緻密部におけるドーパミン作動性ニューロン（ＤａＮ）の進行性の消失、ならびにレビー小体及びレビー神経突起として知られる細胞質内封入体の存在を特徴とする。これらの封入体は、主にタンパク質α－シヌクレインで構成される。α－シヌクレインをコードする遺伝子（ＳＮＣＡ）の変異または三重化は、これらの特定の家族性ＰＤ症例の原因である。その本来の状態では、α－シヌクレインは、ヒトの脳全体のニューロンのシナプス前終末に見られ、小胞輸送、神経伝達物質の放出及び再取り込みにおいて機能を果たす。
【０００４】
α－シヌクレインなどの多くの遺伝子及びタンパク質がＰＤに関連付けられているが、患者から生きたニューロンを抽出できないこと、及び効果的なＰＤモデルがないことから、疾患の開始及び進行に関する未解決の問題が残っている。患者由来の細胞をｉＰＳＣに再プログラミングすることで、疾患の進行及び病理学的表現型を分子レベルで観察することができる。興味深いことに、より大きな非家族性（孤発性）集団に関する以前のｉＰＳＣ研究において、対照個体に由来するものと比較した場合、明白な違いが示されていない。このため、パーキンソン病の病理を裏打ちする複雑な生物学的背景を表すｉＰＳＣ疾患モデルが、当該技術分野において強く必要とされている。
【０００５】
パーキンソン病をモデル化及び治療するための組成物及び方法が本明細書に記載される。重要なことに、中脳ニューロンの生成、発達を忠実に反映した様式での底板誘導により、神経変性につながる細胞キューを特定することができ、これには、ｉＰＳＣモデルでまだ十分に活用されていない孤発性ＰＤ症例の背後にある複雑な病因が含まれる。そのようなモデルを確立したところ、本発明者らは、本明細書において、ＰＫＣによって一部媒介されるものとして、α－シヌクレイン及びリソソーム分解機能障害のこれまで未知であった役割を特定した。アゴニストを介してＰＫＣをターゲティングすることで、測定可能な結果が改善され、これにより、パーキンソン病の新しい治療手段が提案された。
【発明の概要】
【０００６】
ある量のニューロンを１つ以上の試験化合物と接触させることと、１つ以上のパラメータを測定することと、測定された１つ以上のパラメータに基づいて１つ以上の試験化合物を選択することと、を含む方法が本明細書に記載され、ここで、ニューロンは、血球由来の人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）から分化したものである。他の実施形態では、ニューロンは中脳ニューロンである。他の実施形態では、中脳ニューロンはドーパミン作動性ニューロンである。他の実施形態では、１つ以上のパラメータは、ＰＫＣ活性化を含む。他の実施形態では、１つ以上のパラメータは、ＴＦＥＢ活性化及びＺＫＳＣＡＮ３不活性化のうちの少なくとも一方を含む。他の実施形態では、１つ以上のパラメータはα－シヌクレインタンパク質レベルを含む。他の実施形態では、１つ以上のパラメータは、ＬＡＭＰ１、ＧＣａｓｅ、チロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）、及びドーパミンの活性のうちの少なくとも１つを含む。他の実施形態では、１つ以上のパラメータは、ＬＡＭＰ、ＧＣａｓｅ、チロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）、及びドーパミンの発現レベルのうちの少なくとも１つを含む。他の実施形態では、ある量の血球を、再プログラミング因子をコードする１つ以上のｏｒｉＰ／ＥＢＮＡ１ベクターと接触させること；ある量の再プログラミング因子を血球内に送達すること；及び血球を再プログラミング培地中で培養すること、を含む方法であって、再プログラミング因子の送達及び再プログラミング培地中での培養によって血球由来のｉＰＳＣが生成される、方法によって、血球由来のｉＰＳＣが作製される。他の実施形態では、前記ある量の血球は、神経変性疾患に罹患しているヒト対象から得られる。他の実施形態では、神経変性疾患はパーキンソン病である。他の実施形態では、パーキンソン病は早期発症型パーキンソン病である。他の実施形態では、ニューロンは、ある量の血球由来の人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）を提供すること；形質転換成長因子（ＴＧＦ）－ベータ阻害剤及びアクチビン受容体様キナーゼ（ＡＬＫ）阻害剤の存在下でｉＰＳＣを培養すること；スムーズンドアゴニスト、ＲＨＯキナーゼ（ＲＯＣＫ）阻害剤、及び少なくとも２つの成長因子の存在下でさらに培養すること；レチノイン酸の存在下でさらに培養すること；ならびに、少なくとも３つの追加の成長因子の存在下で培養を継続することを含む方法によって、血球由来のｉＰＳＣから分化したものである。他の実施形態では、形質転換成長因子（ＴＧＦ）－ベータ阻害剤はＬＤＮ－１９３１８９を含み、アクチビン受容体様キナーゼ（ＡＬＫ）阻害剤はＳＢ４３１５４２を含み、スムーズンドアゴニストはプルモルファミンを含み、少なくとも２つの成長因子はソニックヘッジホッグ及び線維芽細胞成長因子８を含み、ＲＯＣＫ阻害剤はＣＨＩＲ９９０１２を含み、少なくとも３つの追加の成長因子は、脳由来神経栄養因子、グリア由来神経栄養因子、及びＴＧＦ－ベータ３を含む。
【０００７】
パーキンソン病に罹患している疑いのある対象における１つ以上のバイオマーカーをアッセイすることと、対象からの１つ以上のバイオマーカーの発現レベルを、パーキンソン病を有しない健康な対象に由来する１つ以上のバイオマーカーのベースラインと比較することと、対象のパーキンソン病を診断することと、を含む、診断方法も、本明細書に記載される。
【０００８】
また、パーキンソン病に罹患している疑いのある対象における１つ以上のバイオマーカーをアッセイすることと、対象からの１つ以上のバイオマーカーの発現レベルを、パーキンソン病を有しない健康な対象に由来する１つ以上のバイオマーカーのベースラインと比較することと、対象のパーキンソン病を予後診断することと、を含む、予後診断方法が本明細書に記載される。
【０００９】
さらに、パーキンソン病に罹患している疑いのある対象における１つ以上のバイオマーカーをアッセイすることと、対象からの１つ以上のバイオマーカーの発現レベルを、パーキンソン病を有しない健康な対象に由来する１つ以上のバイオマーカーのベースラインと比較することと、対象の治療レジメンを選択することと、を含む、治療レジメンを選択する方法が本明細書に記載される。
[本発明1001]
化合物のスクリーニング方法であって、
ある量のニューロンを1つ以上の試験化合物と接触させること、
1つ以上のパラメータを測定すること、及び
測定された前記1つ以上のパラメータに基づいて1つ以上の試験化合物を選択すること
を含み、前記ニューロンが、血球由来の人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）から分化したものである、前記方法。
[本発明1002]
前記ニューロンが中脳ニューロンである、本発明1001の方法。
[本発明1003]
前記中脳ニューロンがドーパミン作動性ニューロンである、本発明1002の方法。
[本発明1004]
前記1つ以上のパラメータがＰＫＣ活性化を含む、本発明1001の方法。
[本発明1005]
前記1つ以上のパラメータが、ＴＦＥＢ活性化及びＺＫＳＣＡＮ3不活性化のうちの少なくとも一方を含む、本発明1001の方法。
[本発明1006]
前記1つ以上のパラメータがα－シヌクレインタンパク質レベルを含む、本発明1001の方法。
[本発明1007]
前記1つ以上のパラメータが、ＬＡＭＰ1、ＧＣａｓｅ、チロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）、及びドーパミンの活性のうちの少なくとも1つを含む、本発明1001の方法。
[本発明1008]
前記1つ以上のパラメータが、ＬＡＭＰ、ＧＣａｓｅ、チロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）、及びドーパミンの発現レベルのうちの少なくとも1つを含む、本発明1001の方法。
[本発明1009]
前記血球由来のｉＰＳＣが、
ある量の血球を、再プログラミング因子をコードする1つ以上のｏｒｉＰ／ＥＢＮＡ1ベクターと接触させること、
ある量の再プログラミング因子を前記血球内に送達すること、及び
前記血球を再プログラミング培地中で培養すること
を含む方法によって作製され、前記再プログラミング因子の送達及び再プログラミング培地中での培養によって血球由来のｉＰＳＣが生成される、本発明1001の方法。
[本発明1010]
前記ある量の血球が、神経変性疾患に罹患しているヒト対象から得られる、本発明1009の方法。
[本発明1011]
前記神経変性疾患がパーキンソン病である、本発明1010の方法。
[本発明1012]
前記パーキンソン病が早期発症型パーキンソン病である、本発明1011の方法。
[本発明1013]
前記ニューロンが、
ある量の血球由来の人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）を提供すること、
形質転換成長因子（ＴＧＦ）－ベータ阻害剤及びアクチビン受容体様キナーゼ（ＡＬＫ）阻害剤の存在下で前記ｉＰＳＣを培養すること、
スムーズンドアゴニスト、ＲＨＯキナーゼ（ＲＯＣＫ）阻害剤、及び少なくとも2つの成長因子の存在下でさらに培養すること、
レチノイン酸の存在下でさらに培養すること、ならびに
少なくとも3つの追加の成長因子の存在下で培養を継続すること
を含む方法によって血球由来のｉＰＳＣから分化したものである、本発明1001の方法。
[本発明1014]
前記形質転換成長因子（ＴＧＦ）－ベータ阻害剤がＬＤＮ－193189を含み、前記アクチビン受容体様キナーゼ（ＡＬＫ）阻害剤がＳＢ431542を含み、前記スムーズンドアゴニストがプルモルファミンを含み、前記少なくとも2つの成長因子がソニックヘッジホッグ及び線維芽細胞成長因子8を含み、前記ＲＯＣＫ阻害剤がＣＨＩＲ99012を含み、前記少なくとも3つの追加の成長因子が、脳由来神経栄養因子、グリア由来神経栄養因子、及びＴＧＦ－ベータ3を含む、本発明1001の方法。
[本発明1015]
診断方法であって、
パーキンソン病に罹患している疑いのある対象における1つ以上のバイオマーカーをアッセイすること、
前記対象からの前記1つ以上のバイオマーカーの発現レベルを、パーキンソン病を有しない健康な対象に由来する前記1つ以上のバイオマーカーのベースラインと比較すること、及び
前記対象のパーキンソン病を診断すること
を含む、前記方法。
[本発明1016]
【図面の簡単な説明】
【００１０】
ＰＤ患者データ。
分化スキーム（ａ）。ＴＨの発現及び形態を示す代表的な画像（ｂ）。分化効率を示すフローサイトメトリーデータであり、各点は、独立した分化の３つの別個のウェルの平均を表す（ｃ）。
総ドーパミン含有量のＨＰＬＣ検出（ｄ）。株ごとに分化効率で正規化したドーパミン含有量のＨＰＬＣ検出（ｅ）。３０日齢のＤａＮにおけるｂＡＣＴ（ハウスキーピング）及びシヌクレインの発現を示すウエスタンブロット（ｆ）。各点は別個の分化からのバンドであり、色はｉｐｓｃ株を示し、データは各分化について０２ｉ対照で正規化した、複数のウエスタンブロットからの相対強度（ｇ）。３０日齢のＤａＮにおけるｑＰＣＲによるＳＮＣＡ発現（ｈ）。
ＲＮＡ－Ｓｅｑ及びプロテオミクスの組み合わせからの重複した転写物及びタンパク質の複合検出（ａ）。一致するトランスクリプトームデータ及びプロテオミクスデータのＰＣＡプロット（ｂ）。ＰＤにおいて上方調節されたＰＣ１成分のＧＳＥＡ分析（ｃ）。
ＰＤにおいて下方調節されたＰＣ１成分のＧＳＥＡ分析（ｄ）。
シクロヘキシミドによる阻害下でのシヌクレイン分解を示す代表的なウエスタンブロット（ａ）。０２ｉ対照及び１９０ｉＰＤ細胞からの３つの別個の分化のウエスタンブロットの平均強度であり、時間＝０のシヌクレイン（ｂ）、シナプトフィジン（ｃ）、及びＴＨ（ｄ）に対する変化倍率として提示する。
２４時間のＭＧ１３２プロテアソーム阻害剤下でのシヌクレイン分解を示すウエスタンブロット（ｅ）。ＰＤＤａＮにおけるＬＡＭＰ１タンパク質の減少を示すウエスタンブロット（ｆ）。ＧＣａｓｅ活性であり、各点は、単一の分化からの３つの別個のウェルの平均である。データは、各分化について０２ｉ対照で正規化し、変化倍率として表した（ｇ）。Ｄ３０ＤａＮ溶解物からの酸化ドーパミンのＮＩＲＦ検出（ｈ）。
ＰＤ株におけるリソソームアゴニストによる処理及びｐ－ＰＫＣａの上昇。指定の化合物で７２時間処理したｄ３０ＤａＮのウエスタンブロット及び相対バンド定量化（ａ）。ｄ３０ＤａＮにおけるｐ－ＰＫＣａのベースラインレベル（ｂ）。
複数のＰＤ株及び対照株からの、ＰＥＰで処理した３０日目のＤａＮ（ｃ）。ＰＥＰ処理のタイムコースおよびシヌクレインレベル（ｄ）。
ＳＮＣＡ（ｅ）およびＴＨ（ｆ）の遺伝子発現のＰＥＰ処理のタイムコース。
追加の対照株及びＰＤ株におけるシヌクレイン及びｐ－ＰＫＣａの上昇の確認（ｇ）。
４段階のタイムコース（ａ）および成熟（ｂ）を含む分化プロトコル。
図６ａの続きを示す。
パーキンソン病の症状の早期発症（ＤａＴｓｃａｎによって確認）を呈する３人の患者ボランティアを、ＣｅｄａｒｓＳｉｎａｉＭｅｄｉｃａｌＣｅｎｔｅｒで評価した。いずれの患者もパーキンソン病の家族歴を報告しなかったため、孤発性疾患起源が示される。詳細な臨床評価及び患者の病歴データが記録されており、インビトロの疾患モデリング研究が将来行われるため、重要な臨床情報を提供し続ける。３人の患者全員がホーン・ヤールスケールで１を呈し、片側の関与及び最小限の機能障害が示される。末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、Ｙａｍａｎａｋａ再プログラミング転写因子ＯＣＴ４、ＫＬＦ、ＳＯＸ２、ＭＹＣ、及びＬｉｎ２８を含む４つのプラスミドを伴うエピソームヌクレオフェクション技法を使用して再プログラミングした。トランスフェクション効率を高めるために、ＥＢＮＡ１も含めた。マウス胚性線維芽細胞（ＭＥＦ）のベッドを含むゼラチンコーティングした組織培養プレートに細胞を播種し、１８～２６日間おいた。３つの株すべてでｉＰＳＣコロニー形成が発生し、複数のクローンを収集して、複数の継代にわたって増殖させた。アルカリホスファターゼ（ＡＰ）染色（２０×）により、未分化組織を示す患者株の細胞膜におけるレベルの上昇が明らかになった。（Ｂ）多能性遺伝子Ｏｃｔ４発現を示す免疫細胞化学（２０×）。ヒト特異的細胞表面抗原マーカーＳＳＥＡ４も発現しており、多能性細胞と一致する分子プロファイルが示されている。患者由来のｉＰＳＣは、ドーパミン作動性（ＤＡ）ニューロンに分化させることができる。画像は、チロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）を発現し、典型的なニューロン形態を示す４０日齢の培養物を示す。これらの細胞は、パーキンソン病を有する患者のレビー小体にも見られるα－シヌクレインを内因的に発現する。２０倍の倍率で撮影した画像。
正常に凍結バンクされたＤＡＮ（０２ｉ対照）。
【発明を実施するための形態】
（【００１１】以降は省略されています）

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