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公開番号2025031164
公報種別公開特許公報(A)
公開日2025-03-07
出願番号2023137200
出願日2023-08-25
発明の名称凍結保護液及び凍結保存方法
出願人国立大学法人東海国立大学機構
代理人弁理士法人三枝国際特許事務所
主分類A01N 1/10 20250101AFI20250228BHJP(農業;林業;畜産;狩猟;捕獲;漁業)
要約【課題】磁性ナノ粒子の分散性が高く、且つ、生体試料の凍結保護効果に優れた凍結保護液を提供する。
【解決手段】生体試料用の凍結保護液であって、式(1)で表される親水性の構成単位と、式(2)で表される疎水性の構成単位と、を有する共重合体を含む、凍結保護液。
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[R¹、R⁵は、H、メチル基等;R²～R⁴は、炭素数1～10の炭化水素基;L1、L2は、単結合、エーテル結合等;R⁶は、炭素数1以上の炭化水素基]
【選択図】なし
特許請求の範囲【請求項１】
生体試料用の凍結保護液であって、
一般式（１）：
TIFF
2025031164000017.tif
35
170
［式中、Ｒ
１
は、水素原子、メチル基又はエチル基を示す。Ｒ
２
、Ｒ
３
及びＲ
４
は、同一又は異なって、炭素数１～１０の炭化水素基を示す。Ｌ１は、単結合、エーテル結合、エステル結合、又はアミド結合を示す。ｐ及びｑは、同一又は異なって、１～６の整数である。］
で表される親水性の構成単位と、
一般式（２）：
TIFF
2025031164000018.tif
26
170
［式中、Ｒ
５
は、水素原子、メチル基又はエチル基を示す。Ｒ
６
は、炭素数１以上の炭化水素基を示す。Ｌ２は、単結合、エーテル結合、エステル結合、又はアミド結合を示す。］
で表される疎水性の構成単位と、
を有する共重合体を含む、
凍結保護液。
続きを表示（約 850 文字）【請求項２】
前記共重合体を構成する構成単位の総量を１００モル％として、
前記親水性の構成単位の含有量が、２０～９９モル％であり、及び
前記疎水性の構成単位の含有量が、１～８０モル％である、
請求項１に記載の凍結保護液。
【請求項３】
前記Ｒ
１
が、水素原子又はメチル基であり、及び
前記Ｒ
５
が、水素原子又はメチル基である、
請求項１又は２に記載の凍結保護液。
【請求項４】
前記Ｒ
２
、Ｒ
３
及びＲ
４
が、メチル基である、請求項１又は２に記載の凍結保護液。
【請求項５】
前記ｐ及びｑが、同一又は異なって、１～３の整数である、請求項１又は２に記載の凍結保護液。
【請求項６】
前記Ｒ
６
が、炭素数２以上の炭化水素基である、請求項１又は２に記載の凍結保護液。
【請求項７】
前記Ｌ１及びＬ２が、エステル結合である、請求項１又は２に記載の凍結保護液。
【請求項８】
前記共重合体の含有量が、前記凍結保護液の総量を１００質量％として、１０質量％以上である、請求項１又は２に記載の凍結保護液。
【請求項９】
ジメチルスルホキシド、ホルムアミド及びプロピレングリコールをさらに含み、
前記凍結保護液の総量に対して、前記共重合体の含有量をＡ（ｗ／ｗ％）とし、
前記凍結保護液の総量に対して、前記ジメチルスルホキシド、前記ホルムアミド及び前記プロピレングリコールの含有量の合計をＢ（ｗ／ｖ％）としたとき、
５５≦Ａ＋Ｂである、
請求項１又は２に記載の凍結保護液。
【請求項１０】
前記生体試料が、細胞、組織又は臓器である、請求項１又は２に記載の凍結保護液。
（【請求項１１】以降は省略されています）
発明の詳細な説明【技術分野】
【０００１】
本発明は、凍結保護液及び凍結保存方法に関する。
続きを表示（約 1,600 文字）【背景技術】
【０００２】
組織移植及び臓器移植によって、毎年多くの患者の命が救われている。しかしながら、移植のための組織及び臓器が地球規模で不足しており、これは、バイオメディシン分野における最も大きな課題の一つである。臓器の冷蔵可能期間は、例えば、心臓や肺で４時間、肝臓や膵臓で８時間、腎臓で３６時間であり、多くの場合は移植に間に合わずに廃棄されている。このため、提供された組織及び臓器を、長期間安定に保存するための技術の開発が求められている。
【０００３】
生体試料を長期に保存するための方法として、生体試料を氷点下で凍結保存する方法が挙げられる。しかしながら、細胞を冷凍及び解凍する際、例えば、細胞内外で氷晶が形成してしまうことによって、細胞膜が物理的に損傷することが知られている。このため、凍結・融解サイクル後には、通常、ほとんどの細胞が死滅してしまう。そこで、解凍後に利用可能な状態で生体試料を凍結保存するには、素早く凍結させ、これを素早く融解させることが重要となる。しかしながら、特に、生体試料が大容量の細胞、分厚い組織、臓器を含む場合に、細胞や組織に損傷のない方法で、均一に急速加温して解凍する技術は確立されていなかった。
【０００４】
本発明者らは、磁性ナノ粒子が交流磁場中で発熱する原理を利用した「ナノ加温Ｎａｎｏｗａｒｍｉｎｇ」技術によって、生体試料を含む凍結保護液の容量に依存せずに均一且つ急速に加温可能であり、これによって、加温速度の低さに起因する再結晶による氷晶形成を誘導することなく細胞凍結液を解凍できたことを報告している（非特許文献１）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
Bioeng Transl Med. 2023;8(4):e10416
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
上記のように、本発明者らは、磁性ナノ粒子を含む凍結保護液を生体組織に灌流することによって均一且つ急速に加温することに成功した。しかしながら、本発明者らは、当該技術を利用する際、凍結保護液中の磁性ナノ粒子の分散性が乏しく、磁性ナノ粒子が灌流後に組織内に沈殿し、これを洗い流せなくなることもまた見出した。
【０００７】
本発明は、上記した従来技術の現状に鑑みてなされたものであり、磁性ナノ粒子の分散性が高く、且つ、生体試料の凍結保護効果に優れた凍結保護液を提供することを主な目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、上記した目的を達成すべく鋭意研究を重ねてきた。その結果、凍結保護液に、所定の親水性の構成単位と疎水性の構成単位とを併せ持つ共重合体を添加することによって、磁性ナノ粒子の分散性が高く、且つ、生体試料の凍結保護効果に優れた凍結保護液を簡便に提供することができることを見出した。本発明者らは、このような知見に基づき、さらに研究を重ね、本発明を完成するに至った。即ち、本発明は、以下の構成を包含する。
【０００９】
項１．生体試料用の凍結保護液であって、
一般式（１）：
【００１０】
TIFF
2025031164000001.tif
35
170
［式中、Ｒ
１
は、水素原子、メチル基又はエチル基を示す。Ｒ
２
、Ｒ
３
及びＲ
４
は、同一又は異なって、炭素数１～１０の炭化水素基を示す。Ｌ１は、単結合、エーテル結合、エステル結合、又はアミド結合を示す。ｐ及びｑは、同一又は異なって、１～６の整数である。］
で表される親水性の構成単位と、
一般式（２）：
（【００１１】以降は省略されています）

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