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公開番号2025020021
公報種別公開特許公報(A)
公開日2025-02-07
出願番号2024115463
出願日2024-07-19
発明の名称フコシダーゼ変異体とその使用
出願人チョファーマインコーポレイテッド
代理人個人,個人,個人,個人,個人
主分類C12N 9/26 20060101AFI20250131BHJP(生化学;ビール;酒精;ぶどう酒;酢;微生物学;酵素学;突然変異または遺伝子工学)
要約【課題】本開示は、増強されたα-(1,6)フコシダーゼ活性を示す、α-フコシダーゼ(α-L-フコシダーゼ)の新規変異体形態を提供すること。
【解決手段】本開示はまた、α-フコシダーゼの新規変異体形態を含む組成物、および複合糖質中のα-(1,6)-連結フコースを切断するためにα-フコシダーゼの新規変異体形態を使用する方法に関する。一実施形態において、本開示は、インビトロでのフコースの改善された酵素的加水分解のためのα-L-フコシダーゼの変異体形態を提供する。
【選択図】なし
特許請求の範囲【請求項１】
配列番号１と少なくとも９５％の配列同一性を有し、アミノ酸位置２４７（Ｋ２４７）に置換変異を有するポリペプチドを含む、変異体α－Ｌ－フコシダーゼ。
続きを表示（約 920 文字）【請求項２】
前記置換変異が、Ｋ２４７Ａ、Ｋ２４７Ｃ、Ｋ２４７Ｄ、Ｋ２４７Ｅ、Ｋ２４７Ｆ、Ｋ２４７Ｇ、Ｋ２４７Ｉ、Ｋ２４７Ｌ、Ｋ２４７Ｍ、Ｋ２４７Ｎ、Ｋ２４７Ｐ、Ｋ２４７Ｑ、Ｋ２４７Ｓ、Ｋ２４７Ｔ、Ｋ２４７Ｖ、Ｋ２４７Ｗ、およびＫ２４７Ｙからなる群より選択される、請求項１に記載の変異体α－Ｌ－フコシダーゼ。
【請求項３】
配列番号２～１８のいずれか１つの配列を有する、請求項１または２に記載の変異体α－Ｌ－フコシダーゼ。
【請求項４】
請求項１～３のいずれか１項に記載の変異体α－Ｌ－フコシダーゼと、少なくとも１つのグリコシダーゼとを含む組成物。
【請求項５】
インビトロで脱フコシル化複合糖質を作製する方法であって、１つまたは複数のフコースを含む複合糖質を、エンドグリコシダーゼおよび請求項１～３のいずれか１項に記載の変異体α－Ｌ－フコシダーゼと順次または同時に接触させるステップを含む、方法。
【請求項６】
（ａ）前記複合糖質を前記エンドグリコシダーゼと接触させるステップ；および
（ｂ）前記複合糖質を請求項１～３のいずれか１項に記載の変異体α－Ｌ－フコシダーゼと接触させるステップ
の連続ステップを含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
（ｃ）反応を終了させるステップをさらに含む、請求項５または６に記載の方法。
【請求項８】
前記ステップ（ｃ）が、約６５℃で１５～２５分間実施される、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記ステップ（ａ）および／またはステップ（ｂ）が、約３７℃で０．５～２時間実施される、請求項６～８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記エンドグリコシダーゼが、エンド－β－Ｎ－アセチルグルコサミニダーゼ（ＮＡＧ）、ＥｎｄｏＡ、ＥｎｄｏＦ１、ＥｎｄｏＦ２、ＥｎｄｏＦ３、ＥｎｄｏＨ、ＥｎｄｏＭ、ＥｎｄｏＳ、ＥｎｄｏＳ２、およびそれらのバリアントである、請求項６～９のいずれか１項に記載の方法。
（【請求項１１】以降は省略されています）
発明の詳細な説明【技術分野】
【０００１】
技術分野
本開示は、増強されたα－（１，６）フコシダーゼ活性を示す、α－フコシダーゼ（α－Ｌ－フコシダーゼ）の新規変異体形態に関する。本開示はまた、α－フコシダーゼの新規変異体形態を含む組成物、および複合糖質中のα－（１，６）－連結フコースを切断するためにα－フコシダーゼの新規変異体形態を使用する方法に関する。
続きを表示（約 2,100 文字）【背景技術】
【０００２】
背景
Ｎ－グリコシル化は、哺乳動物のタンパク質中に観察される最も一般的な翻訳後修飾の一つであり、これらのタンパク質の固有の特徴および生物学的機能を調節する上で重要な役割を果たしている。例えば、Ｎ－グリカンの結合は、タンパク質のフォールディング、安定性、抗原性、および免疫原性に顕著に影響を与え得る。さらに、Ｎ－グリカンは、細胞接着、宿主－病原体相互作用、がん転移および免疫応答など、広範な生物学的認識プロセスに直接関与し得る。哺乳動物のＮ－グリカンは、基本的なオリゴ糖のコア構造を共有するが、シアリル化およびフコシル化など、コア構造に追加の修飾の導入は、生物学的機能に影響を及ぼす構造的多様性の増大したレベルに寄与する。
【０００３】
治療抗体の生理学的活性は、２つの異なるメカニズムによって媒介される。第一のメカニズムは、標的抗原中和またはアポトーシスに関与し、これが治療効力に寄与する。第二のメカニズムは、抗体エフェクター機能、抗体依存性細胞細胞傷害性（ＡＤＣＣ）および補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）に関与し、これらは免疫複合体の形成によって活性化される。治療抗体の臨床効果における、特に抗がん抗体におけるＡＤＣＣの重要性は、患者の白血球受容体（ＦｃγＲ）多型の遺伝子解析を通じて解明されてきた。そのため、バイオ産業界は、抗体の定常領域（Ｆｃ）に結合したＮ－グリカンの修飾を含むＡＤＣＣ増強技術の開発に多大な労力を費やしてきた。抗体のＦｃ領域上のＮ－グリカンの最内側ＧｌｃＮＡｃに結合しているα－（１，６）－連結フコース（コアフコース）の量は、ＡＤＣＣ活性に影響を与えることが知られている。Ｆｃ領域上のＮ－グリカンの最内側ＧｌｃＮＡｃからコアフコースの除去は、非フコシル化抗体のＦｃγＲＩＩＩα受容体に対する結合親和性の増大のため、ＩｇＧのＡＤＣＣ活性を顕著に増強する。
【０００４】
ＩｇＧのフコシル化を減少させることにより、ＦｃγＲＩＩＩα結合およびＡＤＣＣを増強するための数多くのアプローチが開発されてきた。いくつかの戦略は、α－（１，６）フコシルトランスフェラーゼの発現を除去または減少させる生産細胞株の開発に関する。フコシル化を減少させる代替戦略としては、ＲＮＡｉを用いることによりα－（１，６）フコシルトランスフェラーゼ遺伝子をサイレンシングすることが挙げられる。しかし、インビトロでのＮ－グリカンの酵素的脱フコシル化は、Ｎ－グリカンが２つのＦｃドメインの間に埋め込まれているため、依然として困難である。Ｆｃドメインの存在はα－フコシダーゼのフコース残基へのアクセスを制限し、立体障害をもたらし、酵素的脱フコシル化の効率を低下させる。
【０００５】
Ｆｃ領域の外側のＮ－グリカンを除去した後、最内側ＧｌｃＮＡｃ残基からコアフコースを除去できるα－Ｌ－フコシダーゼは、ウシ腎臓由来のα－Ｌ－フコシダーゼ、ヒト由来のα－Ｌ－フコシダーゼ（ＦｕｃＡ１）、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓｆｒａｇｉｌｉｓ由来のα－Ｌ－フコシダーゼ（ＢｆＦｕｃ）、およびＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｃａｓｅｉ由来のα－Ｌ－フコシダーゼＣ（ＡｌｆＣ）など、ごくわずかしか開示されていない。野生型酵素の固有の機能および活性は限定的であり低いため、Ｎ－グリカンからコアフコースを効率的に切断する修飾酵素の開発が求められる。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
概要
一実施形態において、本開示は、インビトロでのフコースの改善された酵素的加水分解のためのα－Ｌ－フコシダーゼの変異体形態を提供する。本開示は、増強されたα－（１，６）フコシダーゼ活性を示す、α－フコシダーゼ（α－Ｌ－フコシダーゼ）の新規変異体形態に関する。本開示はまた、α－フコシダーゼの新規変異体形態を含む組成物、および複合糖質中のα－（１，６）－連結フコースを切断するためにα－フコシダーゼの新規変異体形態を使用する方法に関する。
【０００７】
つの実施形態において、本開示は、配列番号１に対して少なくとも９５％の配列同一性を有し、アミノ酸位置２４７（Ｋ２４７）に置換変異を有するポリペプチドを含む変異体α－Ｌ－フコシダーゼを提供する。
【０００８】
つの実施形態において、本開示は、配列番号１に対して少なくとも９７％の配列同一性を有し、アミノ酸位置２４７（Ｋ２４７）に置換変異を有するポリペプチドを含む変異体α－Ｌ－フコシダーゼを提供する。
【０００９】
つの実施形態において、本開示は、配列番号１に対して少なくとも９９％の配列同一性を有し、アミノ酸位置２４７（Ｋ２４７）に置換変異を有するポリペプチドを含む変異体α－Ｌ－フコシダーゼを提供する。
【００１０】
つの実施形態において、本開示は、配列番号１の配列を有し、アミノ酸位置２４７（Ｋ２４７）に置換変異を有するポリペプチドを含む変異体α－Ｌ－フコシダーゼを提供する。
（【００１１】以降は省略されています）

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