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公開番号2025017882
公報種別公開特許公報(A)
公開日2025-02-06
出願番号2023121211
出願日2023-07-26
発明の名称ゼラチンの製造方法、添加剤および培地
出願人富士フイルム株式会社
代理人弁理士法人特許事務所サイクス
主分類C12P 21/02 20060101AFI20250130BHJP(生化学;ビール;酒精;ぶどう酒;酢;微生物学;酵素学;突然変異または遺伝子工学)
要約【課題】ゼラチン遺伝子を有するメタノール資化性酵母を培養することを含むゼラチンの製造方法において、ゼラチンの生産量が改善された方法を提供すること;並びにゼラチンの生産量が改善することができる、上記のゼラチンの製造方法において使用するための添加剤および培地を提供すること。
【解決手段】グループ1:グリシンおよびセリンの少なくとも一つ、グループ2:ピルビン酸またはその塩、グループ3:グルタチオン、およびグループ4:アルギニンおよびリシンの少なくとも一つ、から選択される少なくとも2つのグループの成分、およびメタノールを培地に添加し、ゼラチン遺伝子を有するメタノール資化性酵母を培養することを含む、ゼラチンの製造方法。
【選択図】なし
特許請求の範囲【請求項１】
グループ１：グリシンおよびセリンの少なくとも一つ
グループ２：ピルビン酸またはその塩
グループ３：グルタチオン、および
グループ４：アルギニンおよびリシンの少なくとも一つ
から選択される少なくとも２つのグループの成分、およびメタノールを培地に添加し、ゼラチン遺伝子を有するメタノール資化性酵母を培養することを含む、ゼラチンの製造方法。
続きを表示（約 1,200 文字）【請求項２】
前記少なくとも２つのグループの成分が、グループ１、グループ２、およびグループ３の成分である、請求項１に記載のゼラチンの製造方法。
【請求項３】
前記少なくとも２つのグループの成分が、
（１）グリシンまたはセリン、ピルビン酸またはその塩、およびグルタチオン、
（２）グリシン、およびピルビン酸またはその塩、
（３）ピルビン酸またはその塩、およびグルタチオン、
（４）ピルビン酸またはその塩、およびアルギニン、
（５）グリシンおよびグルタチオン、または
（６）セリンおよびリシン、
の何れかである、請求項１に記載のゼラチンの製造方法。
【請求項４】
培地１リットルあたり、グリシンの総添加量が１．０ｇ以下であるか、セリンの総添加量が１．０ｇ以下である、請求項１に記載のゼラチンの製造方法。
【請求項５】
培地１リットルあたり、ピルビン酸またはその塩の総添加量が４．６ｇ以下である、請求項１に記載のゼラチンの製造方法。
【請求項６】
培地１リットルあたり、グルタチオンの総添加量が６．２ｇ以下である、請求項１に記載のゼラチンの製造方法。
【請求項７】
培地１リットルあたり、アルギニンの総添加量が０．７ｇ以下であるか、リシンの総添加量が２．３ｇ以下である、請求項１に記載のゼラチンの製造方法。
【請求項８】
メタノール誘導性プロモーターが、ゼラチン遺伝子に作動可能に連結されている、請求項１から７の何れか一項に記載のゼラチンの製造方法。
【請求項９】
前記ゼラチンが、下記式（１）のアミノ酸配列を有する、請求項１から７の何れか一項に記載のゼラチンの製造方法。
Ａ－［（Ｇｌｙ－Ｘ－Ｙ）
ｎ
］
ｍ
－Ｂ式（１）
式中、Ａは１または２以上の任意のアミノ酸残基を示し、Ｂは１または２以上の任意のアミノ酸残基を示し、Ｇｌｙはグリシン残基を示し、ｎ個のＸはそれぞれ独立に任意のアミノ酸残基を示し、ｎ個のＹはそれぞれ独立に任意のアミノ酸残基を示す。ｍは、２～１０の整数を表し、ｎは３～１００の整数を表し、ｎ個のＧｌｙ－Ｘ－Ｙは、全て同一でも一部同一でも互いに異なっていてもよい。
【請求項１０】
前記ゼラチンが、
（Ａ）配列番号１で示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド；
（Ｂ）配列番号１で示されるアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ生体親和性を有するポリペプチド；または
（Ｃ）配列番号１で示されるアミノ酸配列に対して１個若しくは数個のアミノ酸残基が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有し、生体親和性を有するポリペプチド
の何れかである、請求項１から７の何れか一項に記載のゼラチンの製造方法。
（【請求項１１】以降は省略されています）
発明の詳細な説明【技術分野】
【０００１】
本発明は、ゼラチン遺伝子を有するメタノール資化性酵母を培養することを含む、ゼラチンの製造方法に関する。本発明はさらに、上記のゼラチンの製造方法において使用するための添加剤、およびメタノール資化性酵母によるゼラチンの製造に用いるための培地に関する。
続きを表示（約 3,400 文字）【背景技術】
【０００２】
ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ）等のメタノール資化性酵母は、異種タンパク質の有用な発現系として知られている。この発現系の特徴は、メタノールによって誘導されるアルコール酸化酵素遺伝子（ＡＯＸ１）などの強力なプロモーターを使用することである。このプロモーターの下流に異種タンパク質をコードする遺伝子を導入することにより、ゼラチン等の目的とする異種タンパク質を発現および分泌させることができる。
【０００３】
異種タンパク質の収量を改善するため、培養条件を検討する取り組みが知られている。例えば、特許文献１から３には、複数のアミノ酸を含む条件下での培養が記載されているが、ゼラチンの生産に対する影響は不明である。
【０００４】
特許文献４および５には、ゼラチン生産に関しては、コラーゲンを生産するメタノール資化性酵母を、ピルビン酸ナトリウムやグルタチオンの存在下に培養することが記載されているが、他の成分との組み合わせについては十分な検討がされていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
米国特許出願公開ＵＳ２０２０／０１９９５２３
米国特許出願公開ＵＳ２０１５／０２９９６４８
中国特許出願公開ＣＮ１１２５０１０４１Ａ
中国特許出願公開ＣＮ１０６２５６９１１Ａ
中国特許出願公開ＣＮ１１４０４５３２１Ａ
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、ゼラチン遺伝子を有するメタノール資化性酵母を培養することを含むゼラチンの製造方法において、ゼラチンの生産量が改善された方法を提供することを解決すべき課題とする。本発明はさらに、ゼラチンの生産量が改善することができる、上記のゼラチンの製造方法において使用するための添加剤を提供することを解決すべき課題とする。本発明はさらに、ゼラチンの生産量が改善することができる、メタノール資化性酵母によるゼラチンの製造に用いるための培地を提供することを解決すべき課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討した結果、グループ１：グリシンおよびセリンの少なくとも一つ、グループ２：ピルビン酸またはその塩、グループ３：グルタチオン、およびグループ４：アルギニンおよびリシンの少なくとも一つ、から選択される少なくとも２つのグループの成分を用いて、ゼラチン遺伝子を有するメタノール資化性酵母を培養することによって、ゼラチンの生産量を改善できることを見出した。本発明は、上記知見に基づいて完成したものである。
【０００８】
本発明によれば、以下の発明が提供される。
＜１＞グループ１：グリシンおよびセリンの少なくとも一つ
グループ２：ピルビン酸またはその塩
グループ３：グルタチオン、および
グループ４：アルギニンおよびリシンの少なくとも一つ
から選択される少なくとも２つのグループの成分、およびメタノールを培地に添加し、ゼラチン遺伝子を有するメタノール資化性酵母を培養することを含む、ゼラチンの製造方法。
＜２＞上記少なくとも２つのグループの成分が、グループ１、グループ２、およびグループ３の成分である、＜１＞に記載のゼラチンの製造方法。
＜３＞上記少なくとも２つのグループの成分が、
（１）グリシンまたはセリン、ピルビン酸またはその塩、およびグルタチオン、
（２）グリシン、およびピルビン酸またはその塩、
（３）ピルビン酸またはその塩、およびグルタチオン、
（４）ピルビン酸またはその塩、およびアルギニン、
（５）グリシンおよびグルタチオン、または
（６）セリンおよびリシン、
の何れかである、＜１＞又は＜２＞に記載のゼラチンの製造方法。
＜４＞培地１リットルあたり、グリシンの総添加量が１．０ｇ以下であるか、セリンの総添加量が１．０ｇ以下である、＜１＞～＜３＞の何れか一に記載のゼラチンの製造方法。
＜５＞培地１リットルあたり、ピルビン酸またはその塩の総添加量が４．６ｇ以下である、＜１＞～＜４＞の何れか一に記載のゼラチンの製造方法。
＜６＞培地１リットルあたり、グルタチオンの総添加量が６．２ｇ以下である、＜１＞～＜５＞の何れか一に記載のゼラチンの製造方法。
＜７＞培地１リットルあたり、アルギニンの総添加量が０．７ｇ以下であるか、リシンの総添加量が２．３ｇ以下である、＜１＞～＜６＞の何れか一に記載のゼラチンの製造方法。
＜８＞メタノール誘導性プロモーターが、ゼラチン遺伝子に作動可能に連結されている、＜１＞～＜７＞の何れか一に記載のゼラチンの製造方法。
＜９＞上記ゼラチンが、下記式（１）のアミノ酸配列を有する、＜１＞～＜８＞の何れか一に記載のゼラチンの製造方法。
Ａ－［（Ｇｌｙ－Ｘ－Ｙ）
ｎ
］
ｍ
－Ｂ式（１）
式中、Ａは１または２以上の任意のアミノ酸残基を示し、Ｂは１または２以上の任意のアミノ酸残基を示し、Ｇｌｙはグリシン残基を示し、ｎ個のＸはそれぞれ独立に任意のアミノ酸残基を示し、ｎ個のＹはそれぞれ独立に任意のアミノ酸残基を示す。ｍは、２～１０の整数を表し、ｎは３～１００の整数を表し、ｎ個のＧｌｙ－Ｘ－Ｙは、全て同一でも一部同一でも互いに異なっていてもよい。
＜１０＞上記ゼラチンが、
（Ａ）配列番号１で示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド；
（Ｂ）配列番号１で示されるアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ生体親和性を有するポリペプチド；または
（Ｃ）配列番号１で示されるアミノ酸配列に対して１個若しくは数個のアミノ酸残基が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有し、生体親和性を有するポリペプチド
の何れかである、＜１＞～＜９＞の何れか一に記載のゼラチンの製造方法。
＜１１＞グループ１：グリシンおよびセリンの少なくとも一つ
グループ２：ピルビン酸またはその塩
グループ３：グルタチオン、および
グループ４：アルギニンおよびリシンの少なくとも一つ
から選択される少なくとも２つのグループの成分を含む、＜１＞～＜１０＞の何れか一に記載のゼラチンの製造方法において使用するための添加剤。
＜１２＞上記少なくとも２つのグループの成分が、グループ１、グループ２、およびグループ３の成分である、＜１１＞に記載の添加剤。
＜１３＞上記少なくとも２つのグループの成分が、
（１）グリシンまたはセリン、ピルビン酸またはその塩、およびグルタチオン、
（２）グリシン、およびピルビン酸またはその塩、
（３）ピルビン酸またはその塩、およびグルタチオン、
（４）ピルビン酸またはその塩、およびアルギニン、
（５）グリシンおよびグルタチオン、または
（６）セリンおよびリシン、
の何れかである、＜１１＞または＜１２＞に記載の添加剤。
＜１４＞グループ１：グリシンおよびセリンの少なくとも一つ
グループ２：ピルビン酸またはその塩
グループ３：グルタチオン、および
グループ４：アルギニンおよびリシンの少なくとも一つ
から選択される少なくとも２つのグループの成分；
メタノール；
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、ゼラチン遺伝子を有するメタノール資化性酵母を培養することによってゼラチンを製造する際に、ゼラチンの生産量を改善することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
図１は、各例についてのタンパク質収量を示す。
図２は、各例についてのタンパク質収量を示す。
【発明を実施するための形態】
（【００１１】以降は省略されています）

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