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公開番号2025017361
公報種別公開特許公報(A)
公開日2025-02-05
出願番号2024150419,2020544560
出願日2024-09-02,2018-11-01
発明の名称ウイルスベクターの調製手段及び方法並びにその使用
出願人ノバルティスアーゲー
代理人個人,個人,個人
主分類C12N 7/02 20060101AFI20250129BHJP(生化学;ビール;酒精;ぶどう酒;酢;微生物学;酵素学;突然変異または遺伝子工学)
要約【課題】空のカプシドが少なく、宿主細胞タンパク質が少なく、及び/又は夾雑DNAが少く、かつ高い効力を保持するAAVウイルスベクターの製造方法、精製方法並びに前記ベクターを含む医薬組成物を提供する。
【解決手段】製造方法は、a.接着細胞を培養する;b.接着細胞に1つ又は複数のプラスミドをトランスフェクトしてAAVウイルスベクターの産生を可能にする;c.接着細胞を溶解させてAAVウイルスベクターを単離する;d.cの細胞ライセートを酸性化及び清澄化する;e.d.の産物を陽イオン交換クロマトグラフィーを用いて精製する;f.e.の産物をタンジェンシャルフローろ過を用いてろ過する;g.f.の産物を塩化セシウムを緩衝液中で超遠心する; h.g.の産物からAAVウイルスベクターを回収する;及びi.h.で回収したAAVウイルスベクターを製剤化及び充填し、最終医薬製品を産生することを含む。
【選択図】なし
特許請求の範囲【請求項１】
ａ．１～８×１０
１３
ＡＡＶ９ウイルスベクターゲノム／ｍＬ（ｖｇ／ｍＬ）；
ｂ．約７％未満の空のウイルスカプシド；
ｃ．１×１０
１３
ｖｇ／ｍＬ当たり約１００ｎｇ／ｍＬ未満の宿主細胞タンパク質；
ｄ．１×１０
１３
ｖｇ／ｍＬ当たり約５×１０
６
ｐｇ／ｍＬ未満の残留宿主細胞ＤＮＡ
を含む医薬組成物であって；
及び前記１～８×１０
１３
ＡＡＶ９ウイルスベクターゲノム／ｍＬの少なくとも約８０
％が機能性である、組成物。
続きを表示（約 850 文字）【請求項２】
前記ＡＡＶ９ウイルスベクターが、生存運動ニューロン（ＳＭＮ）タンパク質をコード
するポリヌクレオチドを含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記ＡＡＶ９ウイルスベクターが、メチルＣｐＧ結合タンパク質２（ＭＥＣＰ２）タン
パク質をコードするポリヌクレオチドを含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記ＡＡＶ９ウイルスベクターが、スーパーオキシドジスムターゼ１（ＳＯＤ１）を標
的とする低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）をコードするポリヌクレオチドを含む、請
求項１に記載の組成物。
【請求項５】
前記ＡＡＶ９ウイルスベクターが、修飾ＡＡＶ２ＩＴＲ、ニワトリβ－アクチン（Ｃ
Ｂ）プロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）前初期エンハンサー、修飾ＳＶ４０
後期１６ｓイントロン、ウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）ポリアデニル化シグナル、及び非修
飾ＡＡＶ２ＩＴＲを含む、請求項２に記載の組成物。
【請求項６】
前記ポリヌクレオチドが配列番号２のＳＭＮタンパク質をコードする、請求項２又は５
に記載の組成物。
【請求項７】
前記ＡＡＶ９ウイルスベクターが配列番号１を含む、請求項２、５、又は６のいずれか
一項に記載の組成物。
【請求項８】
１．７～２．３×１０
１３
ＡＡＶ９ｖｇ／ｍＬを含む、請求項１～７のいずれか一項に
記載の組成物。
【請求項９】
１．９～２．１×１０
１３
ＡＡＶ９ｖｇ／ｍＬを含む、請求項１～８のいずれか一項に
記載の組成物。
【請求項１０】
約２×１０
１３
ＡＡＶ９ｖｇ／ｍＬを含む、請求項１～９のいずれか一項に記載の組成
物。
（【請求項１１】以降は省略されています）
発明の詳細な説明【技術分野】
【０００１】
配列表
本願は、ＥＦＳ－ＷｅｂからＡＳＣＩＩ形式で提出された配列表を含み、この配列表は
本明細書によって全体として参照により援用される。２０１８年１０月３１日に作成され
た前記ＡＳＣＩＩ複製物は、名称がＡＶＥＸ－００３００１ＷＯ＿ＳＴ２５．ｔｘｔであ
り、１４，６３９バイトのサイズである。
続きを表示（約 3,600 文字）【０００２】
関連出願
本願は、２０１７年１１月８日に出願された米国仮特許出願第６２／５８３，０３５号
明細書に対する優先権を主張するものであり、その内容は全体として参照により本明細書
に援用される。
【０００３】
本開示は、ウイルス粒子の調製及び精製方法並びにそれを含む組成物及び使用に関する
。
【背景技術】
【０００４】
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）はパルボウイルス科（ｐａｒｖｏｖｉｒｉｄａｅ）のメ
ンバーである。ＡＡＶゲノムは、約４．７キロベース（ｋｂ）を含む、且つ非構造Ｒｅｐ
（複製）及び構造Ｃａｐ（カプシド）タンパク質をコードする２つの主要なオープンリー
ディングフレームからなる線状一本鎖ＤＮＡ分子で構成されている。ＡＡＶコード領域に
は、約１４５ヌクレオチド長の、ＤＮＡ複製開始時にプライマーとして機能するヘアピン
構造に折り畳まれることができる分断されたパリンドローム配列を含む２つのシス作用性
逆方向末端反復（ＩＴＲ）配列が隣接する。ＤＮＡ複製におけるその役割に加えて、ＩＴ
Ｒ配列は、ウイルス組込み、宿主ゲノムからのレスキュー、及び成熟ビリオンへのウイル
ス核酸のカプシド化に必要であることが示されている（Ｍｕｚｙｃｚｋａ，（１９９２）
Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｉｃｒｏ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５８：９７－１２９）。
【０００５】
複数のＡＡＶ血清型が存在し、多様な組織向性を提供する。既知の血清型には、例えば
、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８
、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０及びＡＡＶ１１が含まれる。ＡＡＶ９については、米国特許第７
，１９８，９５１号明細書及びＧａｏｅｔａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７８：６３８
１－６３８８（２００４）（これらは本明細書によって全体として参照により援用される
）に記載されている。ＡＡＶ６及びＡＡＶ８の送達の進歩により、単純な全身性静脈内又
は腹腔内注射後に骨格筋及び心筋をこれらの血清型によって形質導入することが可能にな
っている。Ｐａｃａｋｅｔａｌ．，Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．，９９（４）：３－９（２０
０６）及びＷａｎｇｅｔａｌ．，ＮａｔｕｒｅＢｉｏｔｅｃｈ．２３（３）：３２
１－８（２００５）を参照のこと。しかしながら、ＡＡＶを使用して中枢神経系内にある
細胞型を標的とするには、外科的脳実質内注射が必要となっている。Ｋａｐｌｉｔｔｅ
ｔａｌ．，“Ｓａｆｅｔｙａｎｄｔｏｌｅｒａｂｉｌｉｔｙｏｆｇｅｎｅｔ
ｈｅｒａｐｙｗｉｔｈａｎａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄｖｉｒｕｓ（ＡＡ
Ｖ）ｂｏｒｎｅＧＡＤｇｅｎｅｆｏｒＰａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓｄｉｓｅａｓ
ｅ：ａｎｏｐｅｎｌａｂｅｌ，ｐｈａｓｅＩｔｒｉａｌ．”Ｌａｎｃｅｔ，３６
９：２０９７－２１０５；Ｍａｒｋｓｅｔａｌ．，“Ｇｅｎｅｄｅｌｉｖｅｒｙ
ｏｆＡＡＶ２－ｎｅｕｒｔｕｒｉｎｆｏｒＰａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓｄｉｓｅａｓ
ｅ：ａｄｏｕｂｌｅ－ｂｌｉｎｄ，ｒａｎｄｏｍｉｚｅｄ，ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄｔ
ｒｉａｌ．”ＬａｎｃｅｔＮｅｕｒｏｌ９：１１６４－１１７２；及びＷｏｒｇａｌ
ｌｅｔａｌ．，“Ｔｒｅａｔｍｅｎｔｏｆｌａｔｅｉｎｆａｎｔｉｌｅｎｅ
ｕｒｏｎａｌｃｅｒｏｉｄｌｉｐｏｆｕｓｃｉｎｏｓｉｓｂｙＣＮＳａｄｍｉ
ｎｉｓｔｒａｔｉｏｎｏｆａｓｅｒｏｔｙｐｅ２ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａ
ｔｅｄｖｉｒｕｓｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇＣＬＮ２ｃＤＮＡ．”ＨｕｍＧｅｎｅ
Ｔｈｅｒ，１９（５）：４６３－７４を参照のこと。
【０００６】
ＡＡＶ血清型２型（ＡＡＶ２）ゲノムのヌクレオチド配列は、Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ
ｅｔａｌ．，ＪＶｉｒｏｌ，４５：５５５－５６４（１９８３）に提示され、Ｒｕｆ
ｆｉｎｇｅｔａｌ．，ＪＧｅｎＶｉｒｏｌ，７５：３３８５－３３９２（１９９
４）によって訂正されたとおりである。ＩＴＲ内には、ウイルスＤＮＡ複製（ｒｅｐ）、
カプシド化／パッケージング及び宿主細胞染色体組込みを指図するシス作用配列が含まれ
る。３つのＡＡＶプロモーター（その相対マッピング位置からｐ５、ｐ１９、及びｐ４０
と呼ばれる）が、ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子をコードする２つのＡＡＶ内部オープンリーデ
ィングフレームの発現をドライブする。２つのｒｅｐプロモーター（ｐ５及びｐ１９）が
、単一のＡＡＶイントロンの差次的スプライシング（ヌクレオチド２１０７及び２２２７
における）と共に、ｒｅｐ遺伝子から４つのｒｅｐタンパク質（ｒｅｐ７８、ｒｅｐ６８
、ｒｅｐ５２、及びｒｅｐ４０）の産生をもたらす。ｒｅｐタンパク質は複数の酵素的特
性を備え、最終的にはそれらがウイルスゲノムの複製に関与する。ｃａｐ遺伝子はｐ４０
プロモーターから発現し、３つのカプシドタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２、及びＶＰ３をコー
ドする。選択的スプライシング部位及び非コンセンサス翻訳開始部位が、これらの３つの
関連するカプシドタンパク質の産生に関与する。単一のコンセンサスポリアデニル化部位
が、ＡＡＶゲノムのマッピング位置９５に位置する。ＡＡＶのライフサイクル及び遺伝学
については、Ｍｕｚｙｃｚｋａ，ＣｕｒｒｅｎｔＴｏｐｉｃｓｉｎＭｉｃｒｏｂｉ
ｏｌｏｇｙａｎｄＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１５８：９７－１２９（１９９２）にレビ
ューされている。
【０００７】
ＡＡＶに由来するベクターは、（ｉ）筋線維及びニューロンを含めた多様な非分裂及び
分裂細胞型に感染（形質導入）することが可能であり；（ｉｉ）ウイルス構造遺伝子を欠
いているため、ウイルス感染に対する天然の宿主細胞応答、例えばインターフェロン媒介
性応答がなくなり；（ｉｉｉ）野生型ウイルスはこれまでヒトにおけるいかなる病理とも
関連付けられたことがなく；（ｉｖ）宿主細胞ゲノムへの組込み能を有する野生型ＡＡＶ
と対照的に、複製欠損ＡＡＶベクターは概してエピソームとして残り、従って癌遺伝子の
挿入突然変異誘発又は活性化のリスクが限定され；及び（ｖ）他のベクター系と対照的に
、ＡＡＶベクターは顕著な免疫応答を引き起こさず（ｉｉを参照）、従って治療用トラン
ス遺伝子の長期発現を（その遺伝子産物が拒絶されないならば）もたらすという理由で、
遺伝子材料の送達に特に魅力的である。
【０００８】
自己相補的アデノ随伴ベクター（ｓｃＡＡＶ）は、天然に存在するアデノ随伴ウイルス
（ＡＡＶ）から遺伝子療法における使用向けに操作されたウイルスベクターである。ｓｃ
ＡＡＶは、コード領域が分子内二本鎖ＤＮＡ鋳型を形成するように設計されているため「
自己相補的」と称される。典型的なＡＡＶゲノムは一本鎖ＤＮＡ鋳型であるため、標準的
なＡＡＶゲノムライフサイクルの律速段階は第２鎖合成を伴う。しかしながら、ｓｃＡＡ
Ｖゲノムにはこれは当てはまらない。感染時、細胞媒介性の第２鎖合成を待つのでなく、
むしろｓｃＡＡＶの２つの相補的な半分が会合して、いつでも複製及び転写できる状態の
１つの二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）単位を形成することになる。
【発明の概要】
【０００９】
例えば、空のカプシドが少なく、宿主細胞タンパク質が少なく、及び／又は夾雑ＤＮＡ
が少ないながらも高い効力を保持しているＡＡＶ医薬製品の規模拡張性のある製造及び精
製方法を開発することが依然として必要とされている。
【００１０】
本開示は、ＡＡＶ粒子調製物を含めた精製ウイルス粒子調製物の調製方法を提供する。
（【００１１】以降は省略されています）

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