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公開番号2025016685
公報種別公開特許公報(A)
公開日2025-02-04
出願番号2024193194,2021554695
出願日2024-11-01,2020-03-13
発明の名称フェニルアラニンヒドロキシラーゼ(PAH)治療薬を発現するための非ウイルス性DNAベクターおよびその使用
出願人ジェネレーションバイオカンパニー
代理人個人,個人,個人,個人,個人
主分類C12N 15/53 20060101AFI20250128BHJP(生化学;ビール;酒精;ぶどう酒;酢;微生物学;酵素学;突然変異または遺伝子工学)
要約【課題】フェニルアラニンヒドロキシラーゼ(PAH)治療薬を発現するための非ウイルス性DNAベクターおよびその使用の提供。
【解決手段】本出願は、導入遺伝子の送達および発現のための直鎖状で連続的な構造を有するceDNAベクターについて説明する。ceDNAベクターは、2つのITR配列に隣接する発現カセットを含み、発現カセットは、PAHタンパク質をコードする導入遺伝子をコードする。一部のceDNAベクターは、調節スイッチを含むシス調節エレメントをさらに含む。ceDNAベクターを使用した、インビトロ、エクスビボ、およびインビボでのPAHタンパク質の信頼できる遺伝子発現のための方法および細胞株が本明細書にさらに提供される。細胞、組織、または対象におけるPAHタンパク質の発現に有用なceDNAベクターを含む方法および組成物、ならびにPAHタンパク質を発現する当該ceDNAベクターによる疾患の治療方法が本明細書に提供される。このようなPAHタンパク質は、疾患、例えば、フェニルケトン尿症(PKU)を治療するために発現され得る。
【選択図】なし
特許請求の範囲【請求項１】
フェニルアラニンヒドロキシラーゼ（ＰＡＨ）タンパク質をコードするヌクレオチド配列であって、前記ヌクレオチド配列が、配列番号３８２、配列番号３８０、配列番号３８１、配列番号３８３、配列番号３８４、配列番号３８５、配列番号３８６、配列番号３８７、配列番号３８８、配列番号３８９、配列番号３９０、配列番号３９１、配列番号３９２、配列番号３９３および配列番号３９４からなる群から選択される配列と少なくとも９０％の同一性を有する配列を含む、ヌクレオチド配列。
続きを表示（約 1,300 文字）【請求項２】
前記ヌクレオチド配列が、配列番号３８２、配列番号３８０、配列番号３８１、配列番号３８３、配列番号３８４、配列番号３８５、配列番号３８６、配列番号３８７、配列番号３８８、配列番号３８９、配列番号３９０、配列番号３９１、配列番号３９２、配列番号３９３および配列番号３９４からなる群から選択される配列と少なくとも９５％の同一性を有する配列を含む、請求項１に記載のヌクレオチド配列。
【請求項３】
前記ヌクレオチド配列が、配列番号３８２、配列番号３８０、配列番号３８１、配列番号３８３、配列番号３８４、配列番号３８５、配列番号３８６、配列番号３８７、配列番号３８８、配列番号３８９、配列番号３９０、配列番号３９１、配列番号３９２、配列番号３９３および配列番号３９４からなる群から選択される配列と少なくとも９７％の同一性を有する配列を含む、請求項１に記載のヌクレオチド配列。
【請求項４】
前記ヌクレオチド配列が、配列番号３８２、配列番号３８０、配列番号３８１、配列番号３８３、配列番号３８４、配列番号３８５、配列番号３８６、配列番号３８７、配列番号３８８、配列番号３８９、配列番号３９０、配列番号３９１、配列番号３９２、配列番号３９３および配列番号３９４からなる群から選択される配列と少なくとも９８％の同一性を有する配列を含む、請求項１に記載のヌクレオチド配列。
【請求項５】
前記ヌクレオチド配列が、配列番号３８２、配列番号３８０、配列番号３８１、配列番号３８３、配列番号３８４、配列番号３８５、配列番号３８６、配列番号３８７、配列番号３８８、配列番号３８９、配列番号３９０、配列番号３９１、配列番号３９２、配列番号３９３および配列番号３９４からなる群から選択される配列と少なくとも９９％の同一性を有する配列を含む、請求項１に記載のヌクレオチド配列。
【請求項６】
前記ヌクレオチド配列が配列番号３８２を含む、請求項１～５のいずれか一項に記載のヌクレオチド配列。
【請求項７】
前記ヌクレオチド配列が配列番号３８２からなる、請求項１～６のいずれか一項に記載のヌクレオチド配列。
【請求項８】
隣接する逆位末端反復（ＩＴＲ）間に位置付けられた少なくとも１つの請求項１～７のいずれか一項に記載のヌクレオチド配列を含む、カプシド不含閉端ＤＮＡ（ｃｅＤＮＡ）ベクター。
【請求項９】
前記ｃｅＤＮＡベクターが、少なくとも１つのＰＡＨタンパク質をコードする前記少なくとも１つのヌクレオチド配列に連結されたプロモーターを含む、請求項８に記載のｃｅＤＮＡベクター。
【請求項１０】
前記ｃｅＤＮＡベクターが、
（ｉ）エンハンサー；
（ｉｉ）５’ＵＴＲおよび／もしくはイントロン配列；
（ｉｉｉ）３’ＵＴＲ；ならびに／または
（ｉｖ）少なくとも１つのポリＡ配列
をさらに含む、請求項８または請求項９のいずれか一項に記載のｃｅＤＮＡベクター。
（【請求項１１】以降は省略されています）
発明の詳細な説明【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
この出願は、２０１９年３月１３日に出願された米国仮出願第６２／８１７，７７１号および２０１９年６月５日に出願された米国仮出願第６２／８５７，５１４号に対する優先権を主張し、それらの各々の内容は、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。
続きを表示（約 3,200 文字）【０００２】
配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩ形式で電子的に提出されている配列表、ならびに本明細書の表１～１５の配列を含み、各々が参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。２０２０年３月１０日に作成された当該ＡＳＣＩＩコピーは、１３１６９８－０５７２０＿ＳＬ．ｔｘｔという名前が付けられ、サイズが１１６，８０６バイトである。
【０００３】
本発明は、対象または細胞において導入遺伝子または単離されたポリヌクレオチドを発現するための非ウイルス性ベクターの産生を含む、遺伝子療法の分野に関する。本開示はまた、ポリヌクレオチドを含む核酸構築物、プロモーター、ベクター、および宿主細胞、ならびに外因性ＤＮＡ配列を標的細胞、組織、器官、または生物に送達する方法に関する。例えば、本開示は、非ウイルス性ｃｅＤＮＡベクターを使用して、細胞からフェニルアラニンヒドロキシラーゼ（ＰＡＨ）を発現するための方法、例えば、フェニルケトン尿症（ＰＫＵ）を有する対象の治療のためのＰＡＨ治療用タンパク質を発現する方法を提供する。方法および組成物は、例えば、治療を必要とする対象の細胞または組織においてＰＡＨを発現することによって疾患を治療するために使用することができる。
【背景技術】
【０００４】
遺伝子療法は、遺伝子発現プロファイルにおける異常によって引き起こされる遺伝子変異または後天性疾患のいずれかを罹患している患者についての臨床転帰を向上することを目的とする。遺伝子療法は、障害、疾患、悪性腫瘍などをもたらし得る欠陥遺伝子または異常な調節もしくは発現、例えば、過小発現もしくは過剰発現に起因する医学的状態の治療または予防を含む。例えば、欠陥遺伝子によって引き起こされる疾患または障害は、修復遺伝物質の患者への送達によって治療、予防、もしくは改善され得るか、または患者の中で遺伝物質の治療的発現をもたらす、例えば、患者に対する修復遺伝物質を用いて欠陥遺伝子を改変もしくはサイレンシングすることによって治療、予防、もしくは改善され得る。
【０００５】
遺伝子療法の基礎は、転写カセットに活性遺伝子産物（導入遺伝子と称される場合がある）を供給することであり、例えば、正の機能獲得効果、負の機能喪失効果、または別の結果をもたらし得る。そのような結果は、抗体、機能的酵素、または融合タンパク質などの治療用タンパク質の発現に起因し得る。遺伝子療法を使用して、他の因子によって引き起こされる疾患または悪性腫瘍を治療することもできる。ヒト単一遺伝障害は、標的細胞への正常遺伝子の送達および発現によって治療され得る。患者の標的細胞中の修復遺伝子の送達および発現は、操作されたウイルスおよびウイルス遺伝子送達ベクターの使用を含む、多くの方法を介して実行され得る。利用可能な多くのウイルス由来ベクター（例えば、組換えレトロウイルス、組換えレンチウイルス、組換えアデノウイルスなど）の中で、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）は、遺伝子療法において多用途ベクターとして人気を集めている。
【０００６】
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、パルボウイルス科に属し、より具体的にはディペンドパルボウイルス属を構成する。ＡＡＶ由来のベクター（すなわち、組換えＡＡＶ（ｒＡＶＶ）またはＡＡＶベクター）は、（ｉ）それらが筋細胞およびニューロンを含む多種多様な非分裂および分裂細胞型に感染する（形質導入する）ことができるため、（ｉｉ）それらがウイルス構造遺伝子を欠いていることによって、ウイルス感染に対する宿主細胞応答、例えば、インターフェロン媒介性応答を減少させるため、（ｉｉｉ）野生型ウイルスが、ヒトにおいて非病理的であるとみなされるため、（ｉｖ）宿主細胞ゲノム中に組み込むことができる野生型ＡＡＶと対照的に、複製欠損ＡＡＶベクターは、ｒｅｐ遺伝子を欠き、一般にエピソームとして持続し、したがって挿入変異または遺伝毒性の危険性を限定するため、ならびに（ｖ）他のベクター系と比較して、ＡＡＶベクターは、一般に比較的不良な免疫原であるとみなされ、したがって著しい免疫応答を誘起せず（ｉｉを参照されたい）、したがって治療導入遺伝子のベクターＤＮＡおよび潜在的に長期発現の持続を得るため、遺伝物質を送達するために魅力的である。
【０００７】
しかしながら、ＡＡＶ粒子を遺伝子送達ベクターとして使用することには、いくつかの重大な欠陥が存在する。ｒＡＡＶに関連する１つの重大な欠点は、約４．５ｋｂの異種ＤＮＡのその限定されたウイルスパッケージング能力であり（Ｄｏｎｇｅｔａｌ．，１９９６、Ａｔｈａｎａｓｏｐｏｕｌｏｓｅｔａｌ．，２００４、Ｌａｉｅｔａｌ．，２０１０）、結果として、ＡＡＶベクターの使用は、１５０，０００Ｄａ未満のタンパク質コーディング能力に制限されている。第２の欠点は、集団における野生型ＡＡＶ感染の流行の結果として、ｒＡＡＶ遺伝子療法の候補が、患者からベクターを排除する中和抗体の存在についてスクリーニングされる必要があることである。第３の欠点は、初回治療から除外されなかった患者への再投与を防ぐカプシド免疫原性に関する。患者における免疫系は、「ブースター」ショットとして有効に作用するベクターに応答して、将来の治療を妨げる高力価抗ＡＡＶ抗体を生成する免疫系を刺激し得る。いくつかの最近の報告は、高用量状況における免疫原性との関係を示している。一本鎖ＡＡＶＤＮＡが異種遺伝子発現前に二本鎖ＤＮＡに変換されなければならないことを考えると、別の顕著な欠点は、ＡＡＶ媒介性遺伝子発現の始まりが比較的遅いことである。
【０００８】
追加的に、カプシドを有する従来のＡＡＶビリオンは、ＡＡＶゲノム、ｒｅｐ遺伝子、およびｃａｐ遺伝子を含有するプラスミドを導入することによって産生される（Ｇｒｉｍｍｅｔａｌ．，１９９８）。しかしながら、そのようなカプシド化ＡＡＶウイルスベクターは、ある特定の細胞および組織型を非効率的に形質導入することがわかり、カプシドはまた、免疫応答を誘導する。
【０００９】
したがって、遺伝子療法のためのアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターの使用は、（患者免疫応答に起因する）患者への単回投与、最小ウイルスパッケージング能力（約４．５ｋｂ）に起因するＡＡＶベクター中の送達に好適な導入遺伝子遺伝物質の限定された範囲、および遅いＡＡＶ媒介性遺伝子発現に起因して、限定される。
【００１０】
フェニルケトン尿症（ＰＫＵ）は、ＰＡＨ遺伝子の変異によって引き起こされる、まれな遺伝性の先天性代謝異常症である。フェニルケトン尿症（ＰＫＵ）は、アミノ酸のフェニルアラニンの代謝の減少をもたらす先天性代謝異常症である。未治療のＰＫＵは、知的障害、発作、行動の問題、および精神的障害につながり得る。また、かび臭い匂いおよび肌の色が薄くなる場合がある。ＰＫＵの治療が不十分な母親から生まれた乳児は、心臓の問題、小さな頭部、および低出生体重を有し得る。ＰＫＡは、ＰＡＨ遺伝子の変異によるものであり、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ（ＰＡＨ）の低いレベルをもたらし、すなわち、ＰＫＵを有する対象は、ＰＡＨに変異があり、その酵素活性が不足する。ＰＫＵは常染色体劣性であり、状態が発達するためには遺伝子の両方のコピーが変異している必要があることを意味する。任意の酵素機能が残っているかどうかに応じて、古典的ＰＫＵおよびバリアントＰＫＵの２つの主要なタイプがある。変異したＰＡＨ遺伝子のコピーが１つある人には、典型的には、症状はない。
（【００１１】以降は省略されています）

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