特許ウォッチ

公開番号2025016579
公報種別公開特許公報(A)
公開日2025-02-04
出願番号2024188133,2021102505
出願日2024-10-25,2016-08-25
発明の名称RNAガイド型エンドヌクレアーゼを使用してゲノム工学における特異性を改善する組成物および方法
出願人デュークユニバーシティ
代理人個人,個人,個人,個人
主分類C12N 15/113 20100101AFI20250128BHJP(生化学;ビール;酒精;ぶどう酒;酢;微生物学;酵素学;突然変異または遺伝子工学)
要約【課題】最適化されたガイドRNA(gRNA)を産生する方法の提供。
【解決手段】本明細書で開示するのは、最適化されたガイドRNA(gRNA)、ならびに、標的結合特異性の増大とオフターゲット結合の低下を有する前記最適化されたgRNAを設計および使用する方法である。
【選択図】なし
特許請求の範囲【請求項１】
最適化されたガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を産生する方法であって、
ａ）対象となる標的領域を特定する工程であって、前記対象となる標的領域はプロトスペーサー配列を含む、工程と；
ｂ）対象となる標的領域を標的にする完全長ｇＲＮＡのポリヌクレオチド配列を決定する工程であって、前記完全長ｇＲＮＡはプロトスペーサー－ターゲティング配列またはセグメントを含む、工程と；
ｃ）完全長ｇＲＮＡに対する少なくとも１つ以上のオフターゲット部位を決定する工程と；
ｄ）第１のｇＲＮＡのポリヌクレオチド配列を産生する工程であって、前記第１のｇＲＮＡは完全長ｇＲＮＡおよびＲＮＡセグメントのポリヌクレオチド配列を含み、前記ＲＮＡセグメントは、プロトスペーサー－ターゲティング配列またはセグメントのヌクレオチドセグメントと相補的である、Ｍヌクレオチドの長さを有するポリヌクレオチド配列を含み、前記ＲＮＡセグメントは、完全長ｇＲＮＡのポリヌクレオチド配列の５’末端であり、前記第１のｇＲＮＡは、完全長ｇＲＮＡのポリヌクレオチド配列の５’末端とＲＮＡセグメントとの間のリンカーを任意選択により含み、前記リンカーは、Ｎヌクレオチドの長さを有するポリヌクレオチド配列を含み、前記第１のｇＲＮＡは、プロトスペーサー配列に侵入して、プロトスペーサー配列と相補的であるＤＮＡ配列と結合して、プロトスペーサー－二重鎖を形成することが可能であり、前記第１のｇＲＮＡは、オフターゲット部位に侵入して、オフターゲット部位と相補的であるＤＮＡ配列と結合して、オフターゲット二重鎖を形成することが可能である、工程と；
ｅ）侵入速度論、および第１のｇＲＮＡがプロトスペーサーおよびオフターゲット部位二重鎖内に侵入されたままである寿命を、推定値を算出するまたは計算によってシミュレートする工程であって、ここで、侵入の動力学は、異なるｇＲＮＡのさらなる侵入と、プロトスペーサー配列と相補的であるＤＮＡ配列に対する第１のｇＲＮＡの再アニーリングとの間のエネルギー差を決定することによって、ヌクレオチドごとに推定される、工程と；ｆ）第１のｇＲＮＡのプロトスペーサーおよび／またはオフターゲット部位での推定寿命を、プロトスペーサーおよび／またはオフターゲット部位での完全長ｇＲＮＡまたは切り詰め型ｇＲＮＡ（ｔｒｕ－ｇＲＮＡ）の推定寿命と比較する工程と；
ｇ）リンカー内の０からＮヌクレオチドおよび第１のｇＲＮＡ内の０からＭヌクレオチドをランダム化し、第２のｇＲＮＡを産生し、前記第２のｇＲＮＡを用いてステップ（ｅ）を繰り返す工程と；
ｈ）設計基準を満たすｇＲＮＡ配列に基づいて、最適化されたｇＲＮＡを特定する工程と；
ｉ）最適化されたｇＲＮＡをインビボで試験して、結合の特異性を決定する工程と
を含む方法。
続きを表示（約 2,300 文字）【請求項２】
最適化されたガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を産生する方法であって、
ａ）対象となる標的領域を特定する工程であって、前記対象となる標的領域はプロトスペーサー配列を含む、工程と；
ｂ）対象となる標的領域を標的にする完全長ｇＲＮＡのポリヌクレオチド配列を決定する工程であって、前記完全長ｇＲＮＡはプロトスペーサー－ターゲティング配列またはセグメントを含む、工程と；
ｃ）完全長ｇＲＮＡに対する少なくとも１つ以上のオフターゲット部位を決定する工程と；
ｄ）第１のｇＲＮＡのポリヌクレオチド配列を産生する工程であって、前記第１のｇＲＮＡは完全長ｇＲＮＡおよびＲＮＡセグメントのポリヌクレオチド配列を含み、前記ＲＮＡセグメントは、プロトスペーサー－ターゲティング配列またはセグメントのヌクレオチドセグメントと相補的である、Ｍヌクレオチドの長さを有するポリヌクレオチド配列を含み、前記ＲＮＡセグメントは、完全長ｇＲＮＡのポリヌクレオチド配列の３’末端であり、前記第１のｇＲＮＡは、完全長ｇＲＮＡのポリヌクレオチド配列の３’末端とＲＮＡセグメントとの間のリンカーを任意選択により含み、前記リンカーは、Ｎヌクレオチドの長さを有するポリヌクレオチド配列を含み、前記第１のｇＲＮＡは、プロトスペーサー配列に侵入して、プロトスペーサー配列と相補的であるＤＮＡ配列と結合して、プロトスペーサー－二重鎖を形成することが可能であり、前記第１のｇＲＮＡは、オフターゲット部位に侵入して、オフターゲット部位と相補的であるＤＮＡ配列と結合して、オフターゲット二重鎖を形成することが可能である、工程と；
ｅ）侵入速度論、および第１のｇＲＮＡがプロトスペーサーおよびオフターゲット部位二重鎖内に侵入されたままである寿命を、推定値を算出するまたは計算によってシミュレートする工程であって、ここで、侵入の動力学は、異なるｇＲＮＡのさらなる侵入と、プロトスペーサー配列と相補的であるＤＮＡ配列に対する第１のｇＲＮＡの再アニーリングとの間のエネルギー差を決定することによって、ヌクレオチドごとに推定される、工程と；ｆ）第１のｇＲＮＡのプロトスペーサーおよび／またはオフターゲット部位での推定寿命を、プロトスペーサーおよび／またはオフターゲット部位での完全長ｇＲＮＡまたは切り詰め型ｇＲＮＡ（ｔｒｕ－ｇＲＮＡ）の推定寿命と比較する工程と；
ｇ）リンカー内の０からＮヌクレオチドおよび第１のｇＲＮＡ内の０からＭヌクレオチドをランダム化し、第２のｇＲＮＡを産生し、前記第２のｇＲＮＡを用いてステップ（ｅ）を繰り返す工程と；
ｈ）設計基準を満たすｇＲＮＡ配列に基づいて、最適化されたｇＲＮＡを特定する工程と；
ｉ）最適化されたｇＲＮＡをインビボで試験して、結合の特異性を決定する工程と
を含む方法。
【請求項３】
前記異なるｇＲＮＡのさらなる侵入のエネルギー特性が、（Ｉ）ＤＮＡ－ＤＮＡ塩基対合を切断すること、（ＩＩ）ＲＮＡ－ＤＮＡ塩基対を形成すること、（ＩＩＩ）侵入されていないガイドＲＮＡ内の異なる二次構造を破壊することまたは形成することから生じるエネルギー差、および（ＩＶ）プロトスペーサーと相補的である置き換えられたＤＮＡ鎖と、二次構造には含まれないいずれかの非対合ガイドＲＮＡヌクレオチドとの間の相互作用を形成することまたは破壊することのうちの少なくとも１つのエネルギー特性を決定することによって決定される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記第１のｇＲＮＡの、前記プロトスペーサー配列と相補的であるＤＮＡ配列への再アニーリングのエネルギー特性が、（Ｉ）ＤＮＡ－ＤＮＡ塩基対合を形成すること、（ＩＩ）ＲＮＡ－ＤＮＡ塩基対を切断すること、（ＩＩＩ）新たに侵入されていないガイドＲＮＡ内の異なる二次構造を破壊することまたは形成することから生じるエネルギー差、および（ＩＶ）プロトスペーサーと相補的である置き換えられたＤＮＡ鎖と、二次構造には含まれないいずれかの非対合ガイドＲＮＡヌクレオチドとの間の相互作用を形成することまたは破壊することのうちの少なくとも１つのエネルギー特性を決定することによって決定される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
（Ｖ）ミスマッチにわたる塩基対合、（ＶＩ）Ｃａｓ９タンパク質との相互作用、および／または（ＶＩＩ）追加のヒューリスティクスであって、結合寿命、侵入の程度、侵入するガイドＲＮＡの安定性、またはＣａｓ９切断活性に対するｇＲＮＡ侵入の、他の算出される／シミュレーションされる特性に関する追加のヒューリスティクスのうちの少なくとも１つから、エネルギー的考察を決定することをさらに含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記完全長ｇＲＮＡが、約１５から２０個のヌクレオチドを含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項７】
Ｍが、１から２０である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項８】
Ｍが、４から１０である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記ＲＮＡセグメントが、プロトスペーサー－ターゲティング配列を補完する２から１５個のヌクレオチドを含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項１０】
Ｎが、１から２０である、請求項１または２に記載の方法。
（【請求項１１】以降は省略されています）
発明の詳細な説明【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、その内容全体が参照によって本明細書に組み込まれる、２０１５年８月２５日に出願された米国仮特許出願第６２／２０９，４６６号明細書に対する優先権を主張する。
続きを表示（約 5,100 文字）【０００２】
政府の権利の陳述
本発明は、アメリカ国立科学財団（ＮａｔｉｏｎａｌＳｃｉｅｎｃｅＦｏｕｎｄａｔｉｏｎ）によって拠出された連邦政府助成金第ＭＣＢ１２４４２９７号および第ＣＢＥＴ１１５１０３５号、ならびにアメリカ国立衛生研究所（ＮａｔｉｏｎａｌＩｎｓｔｉｔｕｔｅｓｏｆＨｅａｌｔｈ）によって拠出された連邦政府助成金第Ｆ３２ＧＭ１１２５０２０１号、第Ｒ０１ＤＡ０３６８６５号、および第ＤＰ２ＯＤ００８５８６号に基づいて、政府支援の下で行われた。政府は、本発明に対する一定の権利を有する。
【０００３】
本開示は、最適化されたガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）、ならびに、標的結合特異性の増大とオフターゲット結合の低下を有する前記ｇＲＮＡを設計および使用する方法を対象とする。
【背景技術】
【０００４】
ＲＮＡガイド型エンドヌクレアーゼ、特にタンパク質Ｃａｓ９は、これが、一本鎖「ガイドＲＮＡ」分子によって、ほとんどあらゆる配列を有するＤＮＡを切断するように誘導することができるので、潜在的な「完璧なゲノム工学ツール」として称賛されている。この能力は、いくつかの新たに出現しつつある生物および医療用途のために近年利用され、非常に大きな興奮とその将来の使用の有望性がもたらされている。しかし、実際のゲノム工学は、オフターゲットＤＮＡが、意図せずに損傷および変異されるようにならないように、厳密なＤＮＡ配列を選択的に標的にしてこれを切断する能力の、極めて正確な制御を必要とする。
【０００５】
Ｃａｓ９は、原核生物のＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ（クラスター化され、規則的に間隔が空いた、短い回文配列リピート）のエンドヌクレアーゼ－侵入する外来ＤＮＡに対するＣＲＩＳＰＲ関連の（Ｃａｓ）応答である。この応答中、Ｃａｓ９は、最初にＣＲＩＳＰＲＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）：トランス活性化ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）二重鎖によって結合され、次いで、ｃｒＲＮＡの可変の２０ｂｐセグメントと相補的な２０塩基対（ｂｐ）の「プロトスペーサー」部位を含有するＤＮＡを切断するように誘導される（図１Ａ）。一本鎖－ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）と結合されて、Ｃａｓ９－ｓｇＲＮＡ複合体は、プロトスペーサーの直後にプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ、本明細書では「ＴＧＧ」）が続くという条件で、標的とされるＤＮＡ内の２０ｂｐの「プロトスペーサー」配列と結合する。結合後、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼは、プロトスペーサー内に二本鎖切断（三角形）を生じる。基本的に、Ｃａｓ９が標的にすることができる配列に対する唯一の制約は、化膿レンサ球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９の場合の「ＮＧＧ」などの短いプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）が、外来ＤＮＡ分子におけるプロトスペーサー部位のすぐ後に続かなければならないことである。結晶学的および生化学的実験の解析は、プロトスペーサー結合および切断における特異性が、最初にＣａｓ９タンパク質自体によるＰＡＭ部位の認識、続いて結合したＲＮＡ複合体によるストランド侵入、およびプロトスペーサーとの直接的ワトソン－クリック塩基対合を通して与えられることを示唆している（図１Ａ）。
【０００６】
Ｃａｓ９が、ほとんどあらゆるＤＮＡ部位を標的にするために、一本鎖ＲＮＡヘアピンによってモジュール的に「プログラム」される能力は、近年、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９系がいくつかの異種生物工学用途に再び充てられた後、非常に大きな興奮をもたらしてきた。特に、ｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡ二重鎖の必須成分と組み合わせられて単一の機能性分子となる、一本鎖－ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）ヘアピンが設計されている。このｓｇＲＮＡを用いて、Ｃａｓ９は、著しく容易なゲノム工学のために、様々な生物に導入されて、インビボで標的とされる二本鎖切断を生じることができる。ヌクレアーゼ－ｎｕｌｌＣａｓ９（Ｄ１０Ａ／Ｈ８４０Ａ、「ｄＣａｓ９」としても公知である）およびキメラｄＣａｓ９誘導体はまた、プロモーター部位でまたはプロモーター部位の近くで、インビボで、標的とされる結合を介する遺伝子発現を変更するために、また、標的とされるエピジェネティック修飾を導入するために使用されている。
【０００７】
実際には、Ｃａｓ９によるオフターゲット結合および切断が、その潜在的使用に悪影響を及ぼす可能性があるので、問題である。Ｃａｓ９／ｄＣａｓ９活性の特異性を改善するために、かなりの取り組みが行われている。第１に、最も幅広い取り組みは、ゲノム内に類似の他の配列を伴わない標的配列の賢明な選択によって大きく達成されるが、最近の調査では、これらの方法は、オフターゲット切断を予測する能力が不十分で実施されることが判明した。さらに、ＰＡＭまたはプロトスペーサー結合における特異性を調節または増大することが判明した点変異の導入を通して、タンパク質それ自体を直接的に操作することに対する取り組みが行われている。二本鎖ＤＮＡ切断を実施するのではなくＤＮＡの一本鎖に切れ目を入れるだけのＣａｓ９誘導体も、互いに二本鎖切断を生じるのに十分に近い複数の部位でオフターゲットに切れ目が入れられる可能性が極めて稀であるだろうという仮定の下で、一対で（「ペアードニッカーゼ」）使用される。最後に、より大きな特異性を実現することを目指して、ガイドＲＮＡバリアントそれ自体を産生するいくつかの研究が行われている。プロトスペーサー以降のさらなるヌクレオチドを補完するためにガイドＲＮＡへの５’－伸長部が付加される、以前の取り組みは、インビボでのＣａｓ９切断特異性の増大を示さなかった。それどころか、これは、生細胞内で消化されて、ほぼその標準の長さまで戻ってしまった（図１Ａ）。ゲノム工学における用途について、特に治療用途については、オフターゲットＤＮＡが損傷されない、また、不正な変異が起こらないように、遺伝子ターゲティングにおける極度の特異性が必要とされる。しかし、実際には、その潜在的使用に悪影響を及ぼす可能性がある、Ｃａｓ９によるオフターゲット結合および切断のいくつかの報告が存在している。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系を使用して、オフターゲット結合を減少させる、かつヌクレアーゼ特異性を増大させる必要性が、依然として存在する。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、最適化されたガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を産生する方法を対象とする。この方法は、ａ）対象となる標的領域を特定する工程であって、前記対象となる標的領域はプロトスペーサー配列を含む、工程と；ｂ）対象となる標的領域を標的にする完全長ｇＲＮＡのポリヌクレオチド配列を決定する工程であって、前記完全長ｇＲＮＡはプロトスペーサー－ターゲティング配列またはセグメントを含む、工程と；ｃ）完全長ｇＲＮＡに対する少なくとも１つ以上のオフターゲット部位を決定する工程と；ｄ）第１のｇＲＮＡのポリヌクレオチド配列を産生する工程と（前記第１のｇＲＮＡは完全長ｇＲＮＡおよびＲＮＡセグメントのポリヌクレオチド配列を含み、前記ＲＮＡセグメントは、プロトスペーサー－ターゲティング配列またはセグメントのヌクレオチドセグメントと相補的である、Ｍヌクレオチドの長さを有するポリヌクレオチド配列を含み、前記ＲＮＡセグメントは、完全長ｇＲＮＡのポリヌクレオチド配列の５’末端であり、前記第１のｇＲＮＡは、完全長ｇＲＮＡのポリヌクレオチド配列の５’末端とＲＮＡセグメントとの間のリンカーを任意選択により含み、前記リンカーは、Ｎヌクレオチドの長さを有するポリヌクレオチド配列を含み、前記第１のｇＲＮＡは、プロトスペーサー配列に侵入して、プロトスペーサー配列と相補的であるＤＮＡ配列と結合して、プロトスペーサー－二重鎖を形成することが可能であり、前記第１のｇＲＮＡは、オフターゲット部位に侵入して、オフターゲット部位と相補的であるＤＮＡ配列と結合して、オフターゲット二重鎖を形成することが可能である）；ｅ）侵入速度論、および第１のｇＲＮＡがプロトスペーサーおよびオフターゲット部位二重鎖内に侵入されたままである寿命を、推定値を算出するまたは計算によってシミュレートする工程と（ここで、侵入の動力学は、異なるｇＲＮＡのさらなる侵入と、プロトスペーサー配列と相補的であるＤＮＡ配列に対する第１のｇＲＮＡの再アニーリングとの間のエネルギー差を決定することによって、ヌクレオチドごとに推定される）；ｆ）第１のｇＲＮＡのプロトスペーサーおよび／またはオフターゲット部位での推定寿命を、プロトスペーサーおよび／またはオフターゲット部位での完全長ｇＲＮＡまたは切り詰め型ｇＲＮＡ（ｔｒｕ－ｇＲＮＡ）の推定寿命と比較する工程と；ｇ）リンカー内の０からＮヌクレオチドおよび第１のｇＲＮＡ内の０からＭヌクレオチドをランダム化し、第２のｇＲＮＡを産生し、この第２のｇＲＮＡを用いてステップ（ｅ）を繰り返す工程と；ｈ）設計基準を満たすｇＲＮＡ配列に基づいて、最適化されたｇＲＮＡを特定する工程と；ｉ）最適化されたｇＲＮＡをインビボで試験して、結合の特異性を決定する工程とを含む。
【００１０】
本発明は、最適化されたガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を産生する方法を対象とする。この方法は、ａ）対象となる標的領域を特定する工程であって、前記対象となる標的領域はプロトスペーサー配列を含む、工程と；ｂ）対象となる標的領域を標的にする完全長ｇＲＮＡのポリヌクレオチド配列を決定する工程であって、前記完全長ｇＲＮＡはプロトスペーサー－ターゲティング配列またはセグメントを含む、工程と；ｃ）完全長ｇＲＮＡに対する少なくとも１つ以上のオフターゲット部位を決定する工程と；ｄ）第１のｇＲＮＡのポリヌクレオチド配列を産生する工程と（前記第１のｇＲＮＡは完全長ｇＲＮＡおよびＲＮＡセグメントのポリヌクレオチド配列を含み、前記ＲＮＡセグメントは、プロトスペーサー－ターゲティング配列またはセグメントのヌクレオチドセグメントと相補的である、Ｍヌクレオチドの長さを有するポリヌクレオチド配列を含み、前記ＲＮＡセグメントは、完全長ｇＲＮＡのポリヌクレオチド配列の３’末端であり、前記第１のｇＲＮＡは、完全長ｇＲＮＡのポリヌクレオチド配列の３’末端とＲＮＡセグメントとの間のリンカーを任意選択により含み、前記リンカーは、Ｎヌクレオチドの長さを有するポリヌクレオチド配列を含み、前記第１のｇＲＮＡは、プロトスペーサー配列に侵入して、プロトスペーサー配列と相補的であるＤＮＡ配列と結合して、プロトスペーサー－二重鎖を形成することが可能であり、前記第１のｇＲＮＡは、オフターゲット部位に侵入して、オフターゲット部位と相補的であるＤＮＡ配列と結合して、オフターゲット二重鎖を形成することが可能である）；ｅ）侵入速度論、および第１のｇＲＮＡがプロトスペーサーおよびオフターゲット部位二重鎖内に侵入されたままである寿命を、推定値を算出するまたは計算によってシミュレートする工程と（ここで、侵入の動力学は、異なるｇＲＮＡのさらなる侵入と、プロトスペーサー配列と相補的であるＤＮＡ配列に対する第１のｇＲＮＡの再アニーリングとの間のエネルギー差を決定することによって、ヌクレオチドごとに推定される）；ｆ）第１のｇＲＮＡのプロトスペーサーおよび／またはオフターゲット部位での推定寿命を、プロトスペーサーおよび／またはオフターゲット部位での完全長ｇＲＮＡまたは切り詰め型ｇＲＮＡ（ｔｒｕ－ｇＲＮＡ）の推定寿命と比較する工程と；ｇ）リンカー内の０からＮヌクレオチドおよび第１のｇＲＮＡ内の０からＭヌクレオチドをランダム化し、第２のｇＲＮＡを産生し、この第２のｇＲＮＡを用いてステップ（ｅ）を繰り返す工程と；ｈ）設計基準を満たすｇＲＮＡ配列に基づいて、最適化されたｇＲＮＡを特定する工程と；ｉ）最適化されたｇＲＮＡをインビボで試験して、結合の特異性を決定する工程とを含む。
（【００１１】以降は省略されています）

関連特許