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公開番号2025016484
公報種別公開特許公報(A)
公開日2025-02-04
出願番号2024174804,2021540437
出願日2024-10-04,2020-01-14
発明の名称非抗生物質選択マーカーとしてのβ-ガラクトシダーゼαペプチド及びその使用
出願人ヤンセンバイオテツク,インコーポレーテツド
代理人個人,個人,個人,個人
主分類C12N 1/21 20060101AFI20250128BHJP(生化学;ビール;酒精;ぶどう酒;酢;微生物学;酵素学;突然変異または遺伝子工学)
要約【課題】核酸コンストラクトを選択可能マーカーとして使用する方法を提供する。
【解決手段】核酸コンストラクトは、プロモータに操作可能に連結されたβ-ガラクトシダーゼのアミノ末端フラグメントをコードする核酸配列を含む、単離されたβ-ガラクトシダーゼ発現カセットを含む。また、β-ガラクトシダーゼ発現カセットを含む単離されたベクター、単離されたベクターを生成する方法、及び単離されたベクターを含むキットも提供される。
【選択図】なし
特許請求の範囲【請求項１】
核酸コンストラクトを選択可能マーカーとして使用する方法であって、前記方法が、
ａ．ｌａｃオペロンに欠失を含む宿主細胞を前記核酸コンストラクトと接触させること
であって、前記核酸コンストラクトが、プロモータに操作可能に連結されたβ－ガラクト
シダーゼのアミノ末端フラグメントをコードする核酸配列を含む、単離されたβ－ガラク
トシダーゼ発現カセットを含む、接触させること、及び
ｂ．前記核酸コンストラクトが前記宿主細胞内に維持される条件下で、前記宿主細胞を
成長させること
を含む、前記方法。
続きを表示（約 620 文字）【請求項２】
前記β－ガラクトシダーゼのアミノ末端フラグメントが、配列番号１と少なくとも７５
％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記β－ガラクトシダーゼのアミノ末端フラグメントが、配列番号１のアミノ酸配列を
含む、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記核酸配列が、複製起点を更に含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記複製起点が、高コピー複製起点である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記高コピー複製起点が、ｐＵＣ５７複製起点である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記ｐＵＣ５７複製起点が、配列番号１９の核酸配列を含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記単離されたβ－ガラクトシダーゼ発現カセットが、二量体分解エレメントを更に含
む、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記二量体分解エレメントが、部位特異的リコンビナーゼ認識部位を含む核酸配列を含
む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記二量体分解エレメントが、部位特異的リコンビナーゼをコードする核酸配列を更に
含む、請求項８又は９に記載の方法。
（【請求項１１】以降は省略されています）
発明の詳細な説明【技術分野】
【０００１】
本発明は、非抗生物質選択マーカーを含む単離されたβ－ガラクトシダーゼ発現カセッ
トに関する。具体的には、単離されたβ－ガラクトシダーゼ発現カセットは、プロモータ
に操作可能に連結されたβ－ガラクトシダーゼのアミノ末端フラグメントを含む。また、
β－ガラクトシダーゼ発現カセットを含む単離されたベクター、単離されたベクターを産
生する方法、及び単離されたベクターを含むキットも提供される。
続きを表示（約 2,300 文字）【０００２】
（電子的に提出された配列表の参照）
本出願は、ファイル名「ＪＢＩ６０３１ＵＳＰＳＰ１Ｓｅｑｌｉｓｔ１」及び２０１９
年１月１７日の作成日で、４８ｋｂのサイズを有するＡＳＣＩＩ形式の配列表としてＥＦ
Ｓ－Ｗｅｂを介して電子的に提出される、配列表を含有する。ＥＦＳ－Ｗｅｂを介して提
出された配列表は、本明細書の一部であり、参照によりその全体が本明細書に組み込まれ
る。
【背景技術】
【０００３】
プラスミドベクターは、通常、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現される遺伝子を含有し、プラ
スミドが形質転換又はエレクトロポレーションによって細胞に導入されるとき、プラスミ
ドを含有しないものからプラスミドを含有する細胞を同定又は選択する方法を提供する。
最も一般的に使用される選択可能マーカーは、抗生物質に対する耐性を付与する遺伝子で
ある。しかしながら、抗生物質耐性遺伝子が望ましくないいくつかの状況が存在する。プ
ラスミドを使用して、抗体などの生物製剤の製造細胞株を作製する場合、抗生物質耐性遺
伝子は、通常、除去又は破壊される。遺伝子療法では、抗生物質耐性遺伝子も望ましくな
い。カナマイシン／ネオマイシン耐性遺伝子は、しばしばＦＤＡにより容認されるが、Ｅ
Ｕ規制機関ははるかに厳格である。欧州薬局方は、「別段正当化され、認可されない限り
、特に臨床的に有用な抗生物質に関して選択可能遺伝子マーカーとして使用される抗生物
質耐性遺伝子は、ベクターコンストラクトに含まれない。組み換えプラスミドの他の選択
技術が好ましい」と述べている（「Ｇｅｎｅｔｒａｎｓｆｅｒｍｅｄｉｃａｌｐｒ
ｏｄｕｃｔｓｆｏｒｈｕｍａｎｕｓｅ．」ＥｕｒｏｐｅａｎＰｈａｒｍａｃｏｐ
ｅｉ７．０（２０１１））。細胞株の開発に少量のプラスミドを必要とする場合、抗生
物質選択マーカーの破壊が可能であり得るが、これらの技術は、より多くのプラスミドを
製造する必要がある遺伝子療法用途には実用的ではない。
【０００４】
複製起点及び選択マーカーが合わせて１ｋｂ未満のサイズであるプラスミドベクターが
、インビボでの遺伝子サイレンシングを回避するためのプラスミドに基づく遺伝子療法の
開発に必要である。プラスミド骨格は、３ｋｂ又は４ｋｂ以上のプラスミド骨格を有する
従来のプラスミドと比較して、１ｋｂ以下である場合、マウスにおいて、より長くかつよ
り高いレベルで発現した（Ｌｕｅｔａｌ．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．２０（１１）：２１
１１－９（２０１２））。インビボで発現されなかったＤＮＡの大きなブロックがサイレ
ンシングを誘導したと提案された。したがって、より小さいプラスミド骨格を有するプラ
スミドがはるかに有効であり得る。
【０００５】
より小さいプラスミドはまた、一過性トランスフェクションが治療薬を製造するために
使用される用途にも必要とされる。一例は、プラスミドの大規模なトランスフェクション
が臨床材料を生成するために使用される、アデノ随伴ウイルスベクターの産生である。よ
り小さいプラスミドは、トランスフェクトされなければならないＤＮＡの量を低減し、コ
ストを低減する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
したがって、遺伝子療法用途に使用することができる選択可能マーカーを含むより小さ
いプラスミドを生成する必要性が存在する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
一般的な一態様では、選択可能マーカーとして核酸コンストラクトを使用する方法が提
供される。本方法は、（ａ）ｌａｃオペロンに欠失を含む宿主細胞を核酸コンストラクト
と接触させることであって、核酸コンストラクトが、プロモータに操作可能に連結された
β－ガラクトシダーゼのアミノ末端フラグメントをコードする核酸配列を含む、単離され
たβ－ガラクトシダーゼ発現カセットを含む、接触させること、及び（ｂ）核酸コンスト
ラクトが宿主細胞内に維持される条件下で、宿主細胞を成長させることを含む。
【０００８】
別の一般的な態様では、単離されたβ－ガラクトシダーゼ発現カセットが提供される。
単離されたカセットは、プロモータに操作可能に連結されたβ－ガラクトシダーゼのアミ
ノ末端フラグメントをコードする核酸配列を含む。
【０００９】
ある特定の実施形態では、β－ガラクトシダーゼのアミノ末端フラグメントは、配列番
号１と少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態では
、β－ガラクトシダーゼのアミノ末端フラグメントは、配列番号１のアミノ酸配列を含む
。
【００１０】
ある特定の実施形態では、核酸配列は、複製起点を更に含む。複製起点は、例えば、高
コピー複製起点であり得る。ある特定の実施形態では、高コピー複製起点は、ｐＵＣ５７
複製起点である。ある特定の実施形態では、ｐＵＣ５７複製起点は、配列番号１９の核酸
配列を含む。
（【００１１】以降は省略されています）

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