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公開番号2025016440
公報種別公開特許公報(A)
公開日2025-02-04
出願番号2024165113,2022071002
出願日2024-09-24,2018-03-27
発明の名称単一細胞用のサンプルインデックス付加
出願人ベクトン・ディキンソン・アンド・カンパニー,BECTON, DICKINSON AND COMPANY
代理人個人,個人,個人,個人,個人,個人,個人
主分類C12N 15/11 20060101AFI20250128BHJP(生化学;ビール;酒精;ぶどう酒;酢;微生物学;酵素学;突然変異または遺伝子工学)
要約【課題】サンプル同定のためのシステム、方法、組成物、及びキットの提供。
【解決手段】本明細書に開示されるものには、サンプル同定のためのシステム、方法、組成物、及びキットが含まれる。サンプルインデックス付加組成物は、たとえば、サンプルインデックス付加オリゴヌクレオチドに関連付けられたタンパク質結合試薬を含みうる。異なるサンプルインデックス付加組成物は、異なる配列を有するサンプルインデックス付加オリゴヌクレオチドを含みうる。細胞のサンプル起源が、サンプルインデックス付加オリゴヌクレオチドの配列に基づいて同定されうる。サンプルインデックス付加オリゴヌクレオチドは、バーコードを用いてバーコードを付けられ、デイジーチェーン接続プライマーを用いて伸長されうる。
【選択図】図7
特許請求の範囲【請求項１】
サンプル同定のための方法であって、
複数のサンプルの各々に由来する１つ以上の細胞を、複数のサンプルインデックス付加組成物のうちの１つのサンプルインデックス付加組成物と接触させる工程であって、
前記１つ以上の細胞が、１つ以上のタンパク質標的を含み、前記複数のサンプルインデックス付加組成物の少なくとも１つのサンプルインデックス付加組成物が、２つ以上のタンパク質結合試薬を含み、前記２つ以上のタンパク質結合試薬の各々が、サンプルインデックス付加オリゴヌクレオチドに関連付けられ、前記２つ以上のタンパク質結合試薬の少なくとも１つが、前記１つ以上のタンパク質標的の少なくとも１つに特異的に結合することが可能であり、
前記サンプルインデックス付加オリゴヌクレオチドが、サンプルインデックス付加配列を含み、前記複数のサンプルインデックス付加組成物の少なくとも２つのサンプルインデックス付加組成物のサンプルインデックス付加配列が、異なる配列を含む工程と；
複数のバーコードを用いて、前記サンプルインデックス付加オリゴヌクレオチドにバーコードを付けて、複数のバーコード付きサンプルインデックス付加オリゴヌクレオチドを生成する工程と；
前記複数のバーコード付きサンプルインデックス付加オリゴヌクレオチドのシーケンシングデータを取得する工程と；
前記複数のバーコード付きサンプルインデックス付加オリゴヌクレオチドの少なくとも１つのバーコード付きサンプルインデックス付加オリゴヌクレオチドの前記サンプルインデックス付加配列に基づいて、前記１つ以上の細胞の少なくとも１つの細胞のサンプル起源を同定する工程と、
を含む、方法。
続きを表示（約 3,100 文字）【請求項２】
サンプル同定のための方法であって、
複数のサンプルの各々に由来する１つ以上の細胞を、複数のサンプルインデックス付加組成物のうちの１つのサンプルインデックス付加組成物と接触させる工程であって、
前記１つ以上の細胞の各々が、１つ以上の細胞成分標的を含み、前記複数のサンプルインデックス付加組成物の少なくとも１つのサンプルインデックス付加組成物が、２つ以上の細胞成分結合試薬を含み、前記２つ以上の細胞成分結合試薬の各々が、サンプルインデックス付加オリゴヌクレオチドに関連付けられ、前記２つ以上の細胞成分結合試薬の少なくとも１つが、前記１つ以上の細胞成分標的の少なくとも１つに特異的に結合することが可能であり、
前記サンプルインデックス付加オリゴヌクレオチドが、サンプルインデックス付加配列を含み、前記複数のサンプルインデックス付加組成物の少なくとも２つのサンプルインデックス付加組成物のサンプルインデックス付加配列が、異なる配列を含む工程と；
複数のバーコードを用いて、前記サンプルインデックス付加オリゴヌクレオチドにバーコードを付けて、複数のバーコード付きサンプルインデックス付加オリゴヌクレオチドを生成する工程と；
前記複数のバーコード付きサンプルインデックス付加オリゴヌクレオチドのシーケンシングデータを取得する工程と；
前記複数のバーコード付きサンプルインデックス付加オリゴヌクレオチドの少なくとも１つのバーコード付きサンプルインデックス付加オリゴヌクレオチドの前記サンプルインデックス付加配列に基づいて、前記１つ以上の細胞の少なくとも１つの細胞のサンプル起源を同定する工程と、
を含む、方法。
【請求項３】
前記２つ以上の細胞成分結合試薬が、２つ以上のタンパク質結合試薬を含み、前記２つ以上のタンパク質結合試薬の各々が、対応する細胞成分結合試薬に関連付けられた前記サンプルインデックス付加オリゴヌクレオチドに関連付けられ、前記１つ以上の細胞成分標的が、１つ以上のタンパク質標的を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記少なくとも１つの細胞の前記サンプル起源を同定する工程が、前記少なくとも１つのバーコード付きサンプルインデックス付加オリゴヌクレオチドの前記サンプルインデックス付加配列に基づいて、前記複数のバーコード付き標的のサンプル起源を同定する工程を含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
サンプル同定のための方法であって、
複数のサンプルの各々に由来する１つ以上の細胞を、複数のサンプルインデックス付加組成物のうちの１つのサンプルインデックス付加組成物と接触させる工程であって、
前記１つ以上の細胞の各々が、１つ以上の細胞成分標的を含み、前記複数のサンプルインデックス付加組成物の少なくとも１つのサンプルインデックス付加組成物が、２つ以上の細胞成分結合試薬を含み、前記２つ以上の細胞成分結合試薬の各々が、サンプルインデックス付加オリゴヌクレオチドに関連付けられ、前記２つ以上の細胞成分結合試薬の少なくとも１つが、前記１つ以上の細胞成分標的の少なくとも１つに特異的に結合することが可能であり、
前記サンプルインデックス付加オリゴヌクレオチドが、サンプルインデックス付加配列を含み、前記複数のサンプルインデックス付加組成物の少なくとも２つのサンプルインデックス付加組成物のサンプルインデックス付加配列が、異なる配列を含む工程と；
前記複数のサンプルインデックス付加組成物の少なくとも１つのサンプルインデックス付加オリゴヌクレオチドの前記サンプルインデックス付加配列に基づいて、前記１つ以上の細胞の少なくとも１つの細胞のサンプル起源を同定する工程と、を含む、方法。
【請求項６】
前記２つ以上の細胞成分結合試薬が、２つ以上のタンパク質結合試薬を含み、前記２つ以上のタンパク質結合試薬の各々が、対応する細胞成分結合試薬に関連付けられた前記サンプルインデックス付加オリゴヌクレオチドに関連付けられ、前記１つ以上の細胞成分標的が、１つ以上のタンパク質標的を含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記少なくとも１つの細胞の前記サンプル起源を同定する工程が、
複数のバーコードを用いて、前記複数のサンプルインデックス付加組成物のサンプルインデックス付加オリゴヌクレオチドにバーコードを付けて、複数のバーコード付きサンプルインデックス付加オリゴヌクレオチドを生成する工程と；
前記複数のバーコード付きサンプルインデックス付加オリゴヌクレオチドのシーケンシングデータを取得する工程と；
前記シーケンシングデータ中の前記複数のバーコード付きサンプルインデックス付加オリゴヌクレオチドの少なくとも１つのバーコード付きサンプルインデックス付加オリゴヌクレオチドの前記サンプルインデックス付加配列に基づいて、前記細胞の前記サンプル起源を同定する工程と、を含む、請求項５～６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記少なくとも１つの細胞の前記サンプル起源を同定する工程が、前記複数のサンプルインデックス付加組成物の少なくとも１つのサンプルインデックス付加オリゴヌクレオチドの前記サンプルインデックス付加配列の存在又は非存在を同定する工程を含む、請求項５～７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記サンプルインデックス付加配列の存在又は非存在を同定する工程が、
前記少なくとも１つのサンプルインデックス付加オリゴヌクレオチドを複製して、複数の複製されたサンプルインデックス付加オリゴヌクレオチドを生成する工程と；
前記複数の複製されたサンプルインデックス付加オリゴヌクレオチドのシーケンシングデータを取得する工程と；
前記シーケンシングデータ中の前記少なくとも１つのバーコード付きサンプルインデックス付加オリゴヌクレオチドに対応する前記複数のサンプルインデックス付加オリゴヌクレオチドの複製されたサンプルインデックス付加オリゴヌクレオチドの前記サンプルインデックス付加配列に基づいて、前記細胞の前記サンプル起源を同定する工程と、を含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記少なくとも１つのサンプルインデックス付加オリゴヌクレオチドを複製して、前記複数の複製されたサンプルインデックス付加オリゴヌクレオチドを生成する工程が、前記少なくとも１つのバーコード付きサンプルインデックス付加オリゴヌクレオチドを複製する前に、複製アダプターを、前記少なくとも１つのバーコード付きサンプルインデックス付加オリゴヌクレオチドにライゲートする工程を含み、
前記少なくとも１つのバーコード付きサンプルインデックス付加オリゴヌクレオチドを複製する工程が、前記少なくとも１つのバーコード付きサンプルインデックス付加オリゴヌクレオチドにライゲートされた前記複製アダプターを用いて、前記少なくとも１つのバーコード付きサンプルインデックス付加オリゴヌクレオチドを複製して、前記複数の複製されたサンプルインデックス付加オリゴヌクレオチドを生成する工程を含む、請求項９に記載の方法。
（【請求項１１】以降は省略されています）
発明の詳細な説明【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、２０１７年６月５日出願の米国仮特許出願第６２／５１５，２８５号明細書；２０１７年７月１４日出願の米国仮特許出願第６２／５３２，９０５号明細書；２０１７年７月１４日出願の米国仮特許出願第６２／５３２，９４９号明細書；２０１７年７月１４日出願の米国仮特許出願第６２／５３２，９７１号明細書；２０１７年９月５日出願の米国仮特許出願第６２／５５４，４２５号明細書；２０１７年１０月３０日出願の米国仮特許出願第６２／５７８，９５７号明細書；及び２０１８年３月２０日出願の米国仮特許出願第６２／６４５，７０３号明細書に基づく優先権を主張する。これらの関連出願の各々の内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
続きを表示（約 2,900 文字）【０００２】
配列表の参照
本出願は、電子フォーマットで配列表とともに出願される。配列表は、２０１８年３月２０日に作成された、３，１８１バイトのサイズのＳｅｑｕｅｎｃｅ＿Ｌｉｓｔｉｎｇ＿ＢＤＣＲＩ＿０３３Ａ．ｔｘｔという名称のファイルとして提供される。配列表の電子フォーマットでの情報は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０００３】
本開示は、概して、分子生物学の分野、たとえば、分子バーコーディングを用いて、さまざまなサンプルの細胞を同定し、細胞成分間の相互作用を検出することに関する。
【背景技術】
【０００４】
現在の技術は、細胞の各々を、区画中でバーコード付き試薬ビーズと共局在化（ｃｏ－ｌｏｃａｌｉｚｅｄ）させながら、細胞特異的オリゴヌクレオチドバーコードを、個々の細胞からのポリ（Ａ）ｍＲＮＡ分子に結合することによって、超並列的に（たとえば、１００００個を超える細胞で）単一細胞の遺伝子発現の測定を可能にする。遺伝子発現は、タンパク質発現に影響を与えうる。タンパク質間相互作用は、遺伝子発現及びタンパク質発現に影響を与えうる。タンパク質発現を定量的に分析し、細胞中のタンパク質発現及び遺伝子発現を同時に測定し、細胞中のタンパク質間相互作用を決定しうるシステム及び方法が求められる。
【発明の概要】
【０００５】
本明細書に開示されるものには、サンプル同定のための方法が含まれる。いくつかの実施形態では、本方法は、複数のサンプルの各々に由来する１つ以上の細胞を、複数のサンプルインデックス付加組成物（サンプルインデックス用組成物、sample indexing composition）のうちの１つのサンプルインデックス付加組成物と接触させる工程であって、１つ以上の細胞が、１つ以上の抗原標的を含み、複数のサンプルインデックス付加組成物の少なくとも１つのサンプルインデックス付加組成物が、２つ以上の抗原結合試薬（たとえば、タンパク質結合試薬及び抗体）を含み、２つ以上の抗原結合試薬の各々が、サンプルインデックス付加オリゴヌクレオチドに関連付けられ、２つ以上の抗原結合試薬の少なくとも１つが、１つ以上の抗原標的の少なくとも１つに特異的に結合することが可能であり、サンプルインデックス付加オリゴヌクレオチドが、サンプルインデックス付加配列を含み、複数のサンプルインデックス付加組成物の少なくとも２つのサンプルインデックス付加組成物のサンプルインデックス付加配列が、異なる配列を含む工程と；複数のバーコードを用いて、サンプルインデックス付加オリゴヌクレオチドにバーコードを付けて、複数のバーコード付きサンプルインデックス付加オリゴヌクレオチドを生成する工程と；複数のバーコード付きサンプルインデックス付加オリゴヌクレオチドのシーケンシングデータを取得する工程と；複数のバーコード付きサンプルインデックス付加オリゴヌクレオチドの少なくとも１つのバーコード付きサンプルインデックス付加オリゴヌクレオチドのサンプルインデックス付加配列に基づいて、１つ以上の細胞の少なくとも１つの細胞のサンプル起源を同定する工程（たとえば、少なくとも１つのバーコード付きサンプルインデックス付加オリゴヌクレオチドのサンプルインデックス付加配列に基づいて、複数のバーコード付き標的のサンプル起源を同定する工程）と、を含む。本方法は、たとえば、複数のサンプルインデックス付加組成物の未結合のサンプルインデックス付加組成物を除去する工程を含みうる。
【０００６】
いくつかの実施形態では、サンプルインデックス付加配列は、２５～６０ヌクレオチド長（たとえば、４５ヌクレオチド長）、約１２８ヌクレオチド長、又は少なくとも１２８ヌクレオチド長である。複数のサンプルインデックス付加組成物の少なくとも１０のサンプルインデックス付加組成物のサンプルインデックス付加配列は、異なる配列を含みうる。複数のサンプルインデックス付加組成物の少なくとも１００又は１０００のサンプルインデックス付加組成物のサンプルインデックス付加配列は、異なる配列を含みうる。
【０００７】
いくつかの実施形態では、抗原結合試薬は、抗体、四量体、アプタマー、タンパク質骨格、又はそれらの組合せを含む。サンプルインデックス付加オリゴヌクレオチドは、リンカーを介して抗原結合試薬に結合されうる。オリゴヌクレオチドは、リンカーを含みうる。リンカーは、化学基を含みうる。化学基は、抗原結合試薬に可逆的に又は不可逆的に結合されうる。化学基は、ＵＶ光切断性基、ジスルフィド結合、ストレプトアビジン、ビオチン、アミン、及びそれらの任意の組合せからなる群から選択されうる。
【０００８】
いくつかの実施形態では、複数のサンプルの少なくとも１つのサンプルは、単一細胞を含む。１つ以上の抗原標的の少なくとも１つは、細胞表面上又は細胞の内部にありうる。複数のサンプルのうちの１つのサンプルは、複数の細胞、組織、腫瘍サンプル、又はそれらの任意の組合せを含みうる。複数のサンプルは、哺乳動物サンプル、細菌サンプル、ウイルスサンプル、酵母サンプル、真菌サンプル、又はそれらの任意の組合せを含みうる。
【０００９】
いくつかの実施形態では、未結合のサンプルインデックス付加組成物を除去する工程は、複数のサンプルの各々に由来する１つ以上の細胞を、洗浄緩衝液で洗浄する工程を含む。本方法は、複数のサンプルの各々に由来する１つ以上の細胞を溶解させる工程を含みうる。サンプルインデックス付加オリゴヌクレオチドは、抗原結合試薬から切り離し可能又は切り離し不可能であるように構成されうる。本方法は、抗原結合試薬からサンプルインデックス付加オリゴヌクレオチドを切り離す工程を含みうる。サンプルインデックス付加オリゴヌクレオチドを切り離す工程は、ＵＶ光切断、化学処理（たとえば、ジチオスレイトールなどの還元剤を使用すること）、加熱、酵素処理、又はそれらの任意の組合せにより抗原結合試薬からサンプルインデックス付加オリゴヌクレオチドを切り離す工程を含みうる。
【００１０】
いくつかの実施形態では、サンプルインデックス付加オリゴヌクレオチドは、複数のサンプルの細胞のゲノム配列に対して相同でない。サンプルインデックス付加オリゴヌクレオチドは、分子標識配列、ポリ（Ａ）領域、又はそれらの組合せを含みうる。サンプルインデックス付加オリゴヌクレオチドは、複数のバーコードの少なくとも１つのバーコードの捕捉配列に相補的な配列を含みうる。バーコードの標的結合領域は、捕捉配列を含みうる。標的結合領域は、ポリ（ｄＴ）領域を含みうる。バーコードの捕捉配列に相補的なサンプルインデックス付加オリゴヌクレオチドの配列は、ポリ（Ａ）テールを含みうる。サンプルインデックス付加オリゴヌクレオチドは、分子標識を含みうる。
（【００１１】以降は省略されています）

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