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公開番号2025012969
公報種別公開特許公報(A)
公開日2025-01-24
出願番号2023116193
出願日2023-07-14
発明の名称5-アミノレブリン酸生産菌、その作製方法及びそれを用いた5-アミノレブリン酸の製造方法
出願人KIYAN PHARMA株式会社
代理人個人,個人
主分類C12N 1/21 20060101AFI20250117BHJP(生化学;ビール;酒精;ぶどう酒;酢;微生物学;酵素学;突然変異または遺伝子工学)
要約【課題】遺伝子組換え技術ではあるものの、最終的に作製された株に外来遺伝子を残さない技術、特にセルフクローニング技術を利用することにより、5-アミノレブリン酸高生産性の菌株であって、5-アミノレブリン酸の工業的な生産において安全性の観点から好適な菌株の作製、及び作製した菌株を用いた5-アミノレブリン酸の生産方法を提供する。
【解決手段】5-アミノレブリン酸合成酵素であるHemTをコードする遺伝子(hemT)の上流に、PrrnBプロモーターを含む発現制御領域を有するα-プロテオバクテリア網に属する光合成細菌の菌株であって、当該発現制御領域は該菌株と同種の光合成細菌に由来するものであり、かつ、hemTの発現を誘導するものであり、当該誘導が野生株と比して5-アミノレブリン酸の生産性の増大をもたらすものである、光合成細菌の菌株を作製すること、及び作製した菌株を培養することにより、前記課題が解決される。
【選択図】なし
特許請求の範囲【請求項１】
５－アミノレブリン酸合成酵素であるHemTをコードする遺伝子（hemT）の上流に、リボソームRNAオペロンプロモーター（PrrnB）を含む発現制御領域を有するα－プロテオバクテリア網に属する光合成細菌の菌株であって、当該発現制御領域は該菌株と同種の光合成細菌に由来するものであり、かつ、hemTの発現を誘導するものであり、当該誘導が野生株と比して５－アミノレブリン酸の生産性の増大をもたらすものである、光合成細菌の菌株。
続きを表示（約 380 文字）【請求項２】
請求項１に記載の菌株を培地中で培養し、菌株及び培地中に５－アミノレブリン酸を生成、蓄積させ、培養物から５－アミノレブリン酸を採取することを特徴とする、５－アミノレブリン酸の製造方法。
【請求項３】
５－アミノレブリン酸合成酵素であるHemTをコードする遺伝子（hemT）の上流に、リボソームRNAオペロンプロモーター（PrrnB）を含む発現制御領域を有するα－プロテオバクテリア網に属する光合成細菌の菌株であって、当該発現制御領域は該菌株と同種の光合成細菌に由来するものであり、かつ、hemTの発現を誘導するものであり、当該誘導が野生株と比して５－アミノレブリン酸の生産性の増大をもたらすものである、光合成細菌の菌株を作製する方法であって、PrrnBをhemTと機能的に結合させる工程を含むことを特徴とする、該菌株の作製方法。

発明の詳細な説明【技術分野】
【０００１】
本発明は、セルフクローニング技術を用いたα-プロテオバクテリアのセルフクローニング株の作出、および、作出した株を用いた５－アミノレブリン酸の生産方法に関する。
続きを表示（約 2,200 文字）【背景技術】
【０００２】
５－アミノレブリン酸（ＡＬＡ）は、テトラピロール化合物（ビタミンＢ１２、ヘム、クロロフィルなど）を生合成する色素生合成経路の代謝中間体として広く生物圈に存在し、生体内で重要な役割を果たしている化合物である。また、５－アミノレブリン酸は、除草剤、殺虫剤、植物成長調節剤、植物の光合成増強剤として優れた効果を示す天然化合物である（特許文献１、２）。さらに、５－アミノレブリン酸は、医薬品、サプリメント、化粧品、飼料、肥料などの原料として使用され、広く人々の生活を様々な面から支えている。
【０００３】
５－アミノレブリン酸は、生体内で、グリシンとスクシニルＣｏＡから５－アミノレブリン酸合成酵素によって、もしくはグルタミン酸からグルタミルｔＲＮＡを経て生合成されることが知られている（特許文献３）。
【０００４】
５－アミノレブリン酸の有用性は広く知られているが、実際にそれを利用する場合のひとつの問題は、生産コストが高いことである。かねてより化学合成法が検討されてきたが、未だ十分満足できる方法が開発されていない。
【０００５】
一方、微生物を用いた５－アミノレブリン酸の製造方法も検討されてきた。例えばプロピオニバクテリウム（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、メタノバクテリウム（Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属又はメタノサルチナ（Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ）属等を用いる方法（特許文献４）が提案されている。しかしながら、発酵による５－アミノレブリン酸の生産では生産量が不十分であり、工業的には満足できるものではなかった。
【０００６】
また、光合成細菌であるロドバクター（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ）属の細菌を用いる方法も知られており、当該方法は上記の微生物を用いる方法に比べ生産量が多いことが報告されている（特許文献５等）。さらに、ロドバクター（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ）属の細菌を変異原処理し、５－アミノレブリン酸高生産性の菌株を選抜し、選抜された株に対してさらに変異原処理と選抜を繰り返し行うことによって、５－アミノレブリン酸がより高い変異株を取得し、これを利用する方法も行われてきた（非特許文献１、２）。
【０００７】
５－アミノレブリン酸を微生物に高生産させるための別のアプローチとして、遺伝子組換え技術による微生物株の選抜又は作製が行われてきた。一例として、光合成細菌に由来する５－アミノレブリン酸合成酵素遺伝子を大腸菌に導入して形質転換体を作製すること（非特許文献３、特許文献６）や、光合成細菌に由来する５－アミノレブリン酸合成酵素遺伝子を光合成細菌に導入して形質転換体を作製すること（特許文献７）等が知られている。
【０００８】
生産にかかるコストや生産性といった観点から、５－アミノレブリン酸の工業的な生産に向けて、従来は、主として（１）薬剤誘発突然変異又は（２）遺伝子組換え技術による５－アミノレブリン酸高生産性株の選択又は作製が行われてきた。しかしながら、（１）の場合、所望の高生産性株を取得するまでに複数回の変異導入及び選択を繰り返す必要があり、さらに安全性を担保するために選択した株の性状及び変異遺伝子の丁寧な解析が必要とされる。また、（２）についても、多くの場合、形質転換体が外来遺伝子を含む等の理由から、安全性を担保するために作製した株についての網羅的な性状の解析が必要と考えられている。それゆえ、いずれの場合も、工業的な生産を実現するためには相当の手間及び時間を要しており、しかもしばしば困難性を伴うものであった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
特開昭６１－５０２８１４号公報
特開平２－１３８２０１号公報
特開２０１３－２０８０７４号公報
特開平５－１８４３７６号公報
特開平５－１８４３７６号公報
特開２００５－３３３９０７号公報
特開平９－１７３０７１号公報
【非特許文献】
【００１０】
Nishikawa, S., et al. (1999) Rhodobacter sphaeroides mutants which accumulate 5-aminolevulinic acid under aerobic and dark conditions., J. Biosci. Bioeng., vol. 87, pp. 798-804.
Kamiyama et al. (2000) Production of 5-aminolevulinic acid by a mutant strain of a photosynthetic bacterium. -Monograph-, 生物工学会誌., vol. 78, no. 2, pp. 48-55.
Xie, L. et al., (2003) Appl. Microbiol. Biotechnol., vol. 63, pp. 267-273.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
（【００１１】以降は省略されています）

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