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公開番号2024178483
公報種別公開特許公報(A)
公開日2024-12-25
出願番号2021185397
出願日2021-11-15
発明の名称ウイルス阻害分子とストレプトアビジン変異体との融合タンパク質
出願人国立大学法人東京大学,サヴィッド・セラピューティックス株式会社
代理人弁理士法人特許事務所サイクス
主分類C07K 19/00 20060101AFI20241218BHJP(有機化学)
要約【課題】ウイルス疾患の治療において使用するための、ウイルス阻害分子とストレプトアビジン変異体との融合タンパク質を提供すること。
【解決手段】配列番号1に記載のアミノ酸配列(但し、C末端のPro-Ser-Ala-Ala-Ser-His-His-His-His-His-Hisからなるアミノ酸配列は一部又は全部が欠失していてもよい)の、N末端側及び/又はC末端側に、リンカー配列を介して、分子量20,000以下のウイルス阻害分子が結合している、融合タンパク質。
【選択図】なし
特許請求の範囲【請求項１】
配列番号１に記載のアミノ酸配列（但し、Ｃ末端のPro-Ser-Ala-Ala-Ser-His-His-His-His-His-Hisからなるアミノ酸配列は一部又は全部が欠失していてもよい）の、Ｎ末端側及び／又はＣ末端側に、リンカー配列を介して、分子量２０，０００以下のウイルス阻害分子が結合している、融合タンパク質。
続きを表示（約 1,000 文字）【請求項２】
Ｎ末端側からＣ末端側に、分子量２０，０００以下の分子量２０，０００以下のウイルス阻害分子と、リンカー配列と、配列番号１に記載のアミノ酸配列（但し、Ｃ末端のPro-Ser-Ala-Ala-Ser-His-His-His-His-His-Hisからなるアミノ酸配列は一部又は全部が欠失していてもよい）とをこの順に有する、請求項1に記載の融合タンパク質。
【請求項３】
ウイルス阻害分子がペプチドである、請求項１又は２に記載の融合タンパク質。
【請求項４】
ウイルス阻害分子が、コロナウイルスを阻害する分子である、請求項１から３の何れか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項５】
ウイルス阻害分子が、SARS-CoV-2 receptor binding domain に結合する分子である、請求項１から４の何れか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項６】
ウイルス阻害分子が、配列番号２又は配列番号６に記載のアミノ酸配列を有する、請求項１から５の何れか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項７】
リンカー配列が、グリシン残基及びセリン残基からなり、アミノ酸残基の数が５から２５個である、請求項１から６の何れか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項８】
リンカー配列が、[（Ｇｌｙ）
ｍ
－Ｓｅｒ]
ｎ
（式中、ｍは１～１０の整数を示し、ｎは１～５の整数を示す）で示されるアミノ酸配列である、請求項１から７の何れか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項９】
配列番号３又は配列番号８に記載のアミノ酸配列（但し、Ｃ末端のPro-Ser-Ala-Ala-Ser-His-His-His-His-His-Hisからなるアミノ酸配列は一部又は全部が欠失していてもよい）を有する、請求項１から８の何れか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項１０】
配列番号３又は配列番号８に記載のアミノ酸配列（但し、Ｃ末端のPro-Ser-Ala-Ala-Ser-His-His-His-His-His-Hisからなるアミノ酸配列は一部又は全部が欠失していてもよい）を有する融合タンパク質をコードする核酸。
（【請求項１１】以降は省略されています）
発明の詳細な説明【技術分野】
【０００１】
本発明は、ウイルス阻害分子とストレプトアビジン変異体との融合タンパク質、並びにその利用に関する。
続きを表示（約 3,800 文字）【背景技術】
【０００２】
アビジンとビオチン、あるいはストレプトアビジンとビオチンの間の親和性は非常に高く（Kd=10
-15
から10
-14
M）、生体二分子間の相互作用としては、最も強い相互作用の一つである。現在、アビジン／ストレプトアビジン-ビオチン相互作用は、生化学、分子生物学、あるいは医学の分野で広く応用されている。アビジン／ストレプトアビジンとビオチンの高い結合能と抗体分子とを組み合わせたドラッグデリバリーの方法およびプレターゲティング法が考案されている。これらの研究に関連し、特許文献１には、天然ビオチンに対する親和性を低減させたストレプトアビジン変異体、並びにこの天然ビオチンに対する低親和性のストレプトアビジン変異体に対して高い親和性を有するビオチン改変二量体が報告されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
国際公開ＷＯ２０１５／１２５８２０
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、ウイルス疾患の治療において使用するための、ウイルス阻害分子とストレプトアビジン変異体との融合タンパク質を提供することを解決すべき課題とした。さらに本発明は、上記した融合タンパク質を含む抗ウイルス剤を提供することを解決すべき課題とした。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者は上記課題を解決するために鋭意検討した結果、ウイルス阻害分子として分子量が抗体より小さい分子を選択し、上記分子と、ストレプトアビジン変異体との融合タンパク質を調製した。そして、上記の融合タンパク質により、ウイルス活性を中和できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００６】
即ち、本発明によれば、以下の発明が提供される。
＜１＞配列番号１に記載のアミノ酸配列（但し、Ｃ末端のPro-Ser-Ala-Ala-Ser-His-His-His-His-His-Hisからなるアミノ酸配列は一部又は全部が欠失していてもよい）の、Ｎ末端側及び／又はＣ末端側に、リンカー配列を介して、分子量２０，０００以下のウイルス阻害分子が結合している、融合タンパク質。
＜２＞Ｎ末端側からＣ末端側に、分子量２０，０００以下の分子量２０，０００以下のウイルス阻害分子と、リンカー配列と、配列番号１に記載のアミノ酸配列（但し、Ｃ末端のPro-Ser-Ala-Ala-Ser-His-His-His-His-His-Hisからなるアミノ酸配列は一部又は全部が欠失していてもよい）とをこの順に有する、＜1＞に記載の融合タンパク質。
＜３＞ウイルス阻害分子がペプチドである、＜１＞又は＜２＞に記載の融合タンパク質。
＜４＞ウイルス阻害分子が、コロナウイルスを阻害する分子である、＜１＞から＜３＞の何れか一に記載の融合タンパク質。
＜５＞ウイルス阻害分子が、SARS-CoV-2 receptor binding domain に結合する分子である、＜１＞から＜４＞の何れか一に記載の融合タンパク質。
＜６＞ウイルス阻害分子が、配列番号２又は配列番号６に記載のアミノ酸配列を有する、＜１＞から＜５＞の何れか一に記載の融合タンパク質。
＜７＞リンカー配列が、グリシン残基及びセリン残基からなり、アミノ酸残基の数が５から２５個である、＜１＞から＜６＞の何れか一に記載の融合タンパク質。
＜８＞リンカー配列が、[（Ｇｌｙ）
ｍ
－Ｓｅｒ]
ｎ
（式中、ｍは１～１０の整数を示し、ｎは１～５の整数を示す）で示されるアミノ酸配列である、＜１＞から＜７＞の何れか一に記載の融合タンパク質。
＜９＞配列番号３又は配列番号８に記載のアミノ酸配列（但し、Ｃ末端のPro-Ser-Ala-Ala-Ser-His-His-His-His-His-Hisからなるアミノ酸配列は一部又は全部が欠失していてもよい）を有する、＜１＞から＜８＞の何れか一に記載の融合タンパク質。
＜１０＞配列番号３又は配列番号８に記載のアミノ酸配列（但し、Ｃ末端のPro-Ser-Ala-Ala-Ser-His-His-His-His-His-Hisからなるアミノ酸配列は一部又は全部が欠失していてもよい）を有する融合タンパク質をコードする核酸。
＜１１＞＜１＞から＜９＞の何れか一に記載の融合タンパク質を含む、抗ウイルス剤。
【発明の効果】
【０００７】
本発明によるウイルス阻害分子とストレプトアビジン変異体との融合タンパク質を用いることにより抗ウイルス活性を発揮することができ、これによりウイルス疾患を治療することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
図１は、pHの値を4.0, 5.0, 5.5, 6.0 に調製した0.４Mのアルギニンを含むリフォールディングバッファー 1mLを1.5 mL チューブに分注し、25 μLの変性意識状態のLCB1-Cupidを添加し24時間４℃にてインキュベーションしたのちの４量体形成をSDS-PAGEで解析した結果を示す。75 kDaマーカ付近に現れる４量体分子と25 kDaマーカ付近に現れる単量体分子のバンドを比較するとpH 5.5において４量体分子のバンドの比率が最も高い。
図２は、リフォールディングを行ったLCB1-Cupidの濃縮を行い、溶媒をPBSに置換した後の純度をSDS-PAGEで解析した結果を示す。図1で見えていた25 kDaマーカ付近に現れる単量体分子のバンドが消失して、高純度化されている。
図３は、LCB1-CupidのSARS-CoV-2 RBD (receptor binding domain)への結合による ACE 2 タンパク質との結合阻害を解析した結果を示す。PBSで希釈したAnti-RBD miniproteinは、濃度依存的にSARS-CoV-2 RBD (receptor binding domain)への結合が増加し、ACE 2 タンパク質とSARS-CoV-2 RBDとの結合を阻害している一方で、SARS-CoV-2 RBDへの結合能を有しないz HER2は、濃度依存的な中和活性を示さなかった。
図４は、巻き戻しを検討した３回の結果を示している。レーン１は、濃縮物(4.4 mg/mL)を10μLとサンプルバッファーを10μL混合し他ものを10μLレーンにアプライした。レーン２は、濃縮物を1mg/mL になるようにPBSで希釈したものを10μLとサンプルバッファーを10μL混合したものを10μLレーンにアプライした。
図５は、LCB3-CupidのSARS-CoV-2 RBD (receptor binding domain)への結合による ACE 2 タンパク質との結合阻害を解析した結果を示す。PBSで希釈したLCB3-Cupid (Anti-RBD miniproteinと表記)は、濃度依存的にSARS-CoV-2 RBD (receptor binding domain)への結合が増加し、ACE 2 タンパク質とSARS-CoV-2 RBDとの結合を阻害している一方で、SARS-CoV-2 RBDへの結合能を有しないz HER2は、濃度依存的な中和活性を示さなかった。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
以下、本発明について更に詳細に説明する。
本発明の融合タンパク質は、配列番号１に記載のアミノ酸配列（但し、Ｃ末端のPro-Ser-Ala-Ala-Ser-His-His-His-His-His-His（配列番号５）からなるアミノ酸配列は一部又は全部が欠失していてもよい）の、Ｎ末端側及び／又はＣ末端側に、リンカー配列を介して、分子量２０，０００以下のウイルス阻害分子が結合している、融合タンパク質である。配列番号１に記載のアミノ酸配列（但し、Ｃ末端のPro-Ser-Ala-Ala-Ser-His-His-His-His-His-Hisからなるアミノ酸配列は一部又は全部が欠失していてもよい）の、Ｎ末端側及びＣ末端側に、リンカー配列を介して、分子量２０，０００以下のウイルス阻害分子が結合している場合、当該ウイルス阻害分子は同一でも異なるものでもよい。
【００１０】
好ましくは、本発明の融合タンパク質は、Ｎ末端側からＣ末端側に、分子量２０，０００以下の分子量２０，０００以下のウイルス阻害分子と、リンカー配列と、配列番号１に記載のアミノ酸配列（但し、Ｃ末端のPro-Ser-Ala-Ala-Ser-His-His-His-His-His-Hisからなるアミノ酸配列は一部又は全部が欠失していてもよい）とをこの順に有する融合タンパク質である。
（【００１１】以降は省略されています）

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