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公開番号2025028529
公報種別公開特許公報(A)
公開日2025-03-03
出願番号2023133384
出願日2023-08-18
発明の名称ナノポアタンパク質
出願人キッコーマン株式会社
代理人個人,個人,個人,個人
主分類C07K 14/315 20060101AFI20250221BHJP(有機化学)
要約【課題】ナノポアセンシングに使用できる、新規のナノポアタンパク質を提供すること。
【解決手段】本発明のナノポアタンパク質は、所定の変異を含むコレステロール依存性膜孔形成細胞溶解毒素(CDC)ファミリータンパク質の変異タンパク質である。
【選択図】図4A
特許請求の範囲【請求項１】
下記の（１）～（３）の少なくとも１つの変異を含むコレステロール依存性膜孔形成細胞溶解毒素（ＣＤＣ）ファミリータンパク質の変異タンパク質である、ナノポアタンパク質。
（１）配列番号１に記載のアミノ酸配列における、下記の（ａ）～（ｇ）のいずれか１つの置換
（ａ）３０２位のアルギニンに相当する位置にあるアミノ酸残基のフェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、アラニン、システイン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン若しくはプロリンへの置換
（ｂ）配列番号４８、５１及び５５に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質を除くＣＤＣファミリータンパク質に対する、２４２位のヒスチジンに相当する位置にあるアミノ酸残基のロイシン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、アラニン、システイン、バリン、イソロイシン、メチオニン若しくはプロリンへの置換、
（ｃ）配列番号４９、５３及び１５に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質を除くＣＤＣファミリータンパク質に対する、３３４位のトレオニンに相当する位置にあるアミノ酸残基のフェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、アラニン、システイン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン若しくはプロリンへの置換、
（ｄ）２４１位のバリンに相当する位置にあるアミノ酸残基のグルタミン酸、アルギニン、ヒスチジン、リジン、アスパラギン酸、グリシン、セリン、トレオニン、アスパラギン若しくはグルタミンへの置換
（ｅ）３１５位のトレオニンに相当する位置にあるアミノ酸残基のフェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、アラニン、システイン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン若しくはプロリンへの置換
（ｆ）３３８位のアスパラギンに相当する位置にあるアミノ酸残基のフェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、アラニン、システイン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン若しくはプロリンへの置換
（ｇ）３３９位のイソロイシンに相当する位置にあるアミノ酸残基のセリン、アルギニン、ヒスチジン、リジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、グリシン、トレオニン、アスパラギン若しくはグルタミンへの置換
（２）配列番号１に記載のアミノ酸配列におけるＮ１７８－Ｈ２００のうち、Ｙ１９６－Ｈ２００を含む５～２３個の連続したアミノ酸、又はＷ５１４－Ｖ５２６のうち、Ｔ５１７－Ｌ５１８を含む２～１３個の連続したアミノ酸に相当する位置にあるアミノ酸残基が欠失する変異
（３）配列番号１に記載のアミノ酸配列のＣ末端に、配列番号１に記載のアミノ酸配列におけるＱ５０８－Ｄ５３２のうち、Ｔ５１７－Ｌ５１８を含む連続した２～２５個のアミノ酸残基に相当する位置にあるアミノ酸残基を挿入する変異、又は、配列番号１に記載のアミノ酸配列のＬ５０３とＰ５０４に相当する位置にあるアミノ酸残基の間に、配列番号１に記載のアミノ酸配列におけるＲ４８０－Ｌ５０３のうちＲ４９５を含む１～２４個の連続したアミノ酸残基に相当する位置にあるアミノ酸残基を挿入する変異
続きを表示（約 580 文字）【請求項２】
配列番号１に記載のアミノ酸配列におけるＲ３０２、Ｈ２４２、Ｔ３３４、Ｖ２４１、Ｔ３１５、Ｎ３３８又はＩ３３９に相当する位置にあるアミノ酸残基が、Ｒ３０２Ｆ、Ｒ３０２Ｍ、Ｒ３０２Ｌ、Ｒ３０２Ｉ、Ｈ２４２Ｌ、Ｈ２４２Ｉ、Ｈ２４２Ｙ、Ｔ３３４Ｖ、Ｔ３３４Ｉ、Ｖ２４１Ｔ、Ｖ２４１Ｓ、Ｖ２４１Ｋ、Ｖ２４１Ｅ、Ｔ３１５Ｖ、Ｔ３１５Ｉ、Ｎ３３８Ｌ、Ｎ３３８Ｆ、Ｉ３３９Ｔ、Ｉ３３９Ｓ又はＩ３３９Ｋへの置換による変異を含む、請求項１に記載のナノポアタンパク質。
【請求項３】
配列番号１に記載のアミノ酸配列におけるＲ３０２、Ｈ２４２、Ｔ３３４、Ｖ２４１、Ｔ３１５又はＩ３３９に相当する位置にあるアミノ酸残基が、Ｒ３０２Ｆ、Ｈ２４２Ｌ、Ｈ２４２Ｉ、Ｈ２４２Ｙ、Ｔ３３４Ｖ、Ｔ３３４Ｉ、Ｖ２４１Ｅ、Ｔ３１５Ｖ、Ｔ３１５Ｉ又はＩ３３９Ｓへの置換による変異を含む、請求項２に記載のナノポアタンパク質。
【請求項４】
請求項１～３のいずれか一項に記載のナノポアタンパク質を含む、ナノポアセンサー。
【請求項５】
請求項４に記載のナノポアセンサーを用いた、ナノポアセンシング方法。
【請求項６】
ナノポアタンパク質と、前記ナノポアタンパク質を安定化できる量の界面活性剤を含む、ナノポアタンパク質懸濁液。

発明の詳細な説明【技術分野】
【０００１】
本発明は、ナノポアタンパク質に関する。
続きを表示（約 4,200 文字）【背景技術】
【０００２】
ナノポアを形成する膜タンパク質（ナノポアタンパク質）を用いたナノポアセンシングは、ナノポアを通過する生体分子（特にＤＮＡ）を電気的に検出する方法で、近年この方法を用いた高感度なナノポアＤＮＡシーケンサが実用化されている。生体分子の検出は、人工細胞膜上にナノポアタンパク質を構築し、生体分子が人工細胞膜を通過する際に、膜上のナノポアがイオンの流れを阻害することを利用している。ナノポアタンパク質はその種類ごとに機能やポアサイズが異なる。ナノポアタンパク質として、ナノポアを形成する外膜タンパク質（Ｏｕｔｅｒｍｅｍｂｒａｎｅｐｒｏｔｅｉｎ）のＯｍｐＧ及びＯｍｐＡが知られている。
【０００３】
一方、インターメディリシン（Ｉｎｔｅｒｍｅｄｉｌｙｓｉｎ、ＩＬＹ）はコレステロール依存性膜孔形成細胞溶解毒素ファミリー（ＣｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌＤｅｐｅｎｄｅｎｔＣｙｔｏｌｙｓｉｎＦａｍｉｌｙ、ＣＤＣファミリー）に属する膜タンパク質の一種である（非特許文献１）。ＩＬＹを含むＣＤＣファミリーは数十ｎｍの比較的大きなポアを形成することで知られている（非特許文献１）。ＣＤＣファミリーは、３つの立体構造、つまり水溶液中でモノマーとしてフリーで存在した場合の構造（図１（ａ））、他のモノマーと相互作用可能なプレポア構造（図１（ｂ））、モノマーの一部が脂質二重膜を貫通したポア構造（図１（ｃ））として存在することが知られている（非特許文献２、３）。ＣＤＣファミリーのポアの形成ステップとして、まずモノマーがプレポア構造をとることでモノマー同士の相互作用が可能となり、モノマーがオリゴマー化することで膜表面上にプレポアが形成される。次に、プレポア構造を形成するモノマーがポア構造にコンフォメーションを変化させ、モノマーの一部が脂質二重膜を貫通することで、ポアが形成される。
【０００４】
ナノポアセンシングでは検出対象の分子の大きさ又は形状によって適切なナノポアタンパク質を用いる必要がある。非特許文献４は、バレル状（樽状）のポアを形成するＯｍｐＧ構成するβストランドの本数を増減させることで、ＯｍｐＧのポアサイズの改変させたことを開示している。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
PeraroM. D. and Goot F. G. Nature Reviews, 2016, 14, 77-92
JohnsonS., et al., Cell Reports, 2013, 3, 1369-1377
Shah N.R. et al., Nature Comm., 2020, 11, 5818
TosakaT. and Kamiya K. ACS Appl. Nano Mater., 2022, 5,6149-6158
KawanoR.et al., PLOS ONE, 2014, 9, e102427-e102427
Ohara,M., et al., ACS Synth. Biol., 2017,6, 1427-1432
Saigo,N., et al., ACS Omega, 2019, 4, 13124-13130
YANG,Wayne, et al., Detection of CRISPR-dCas9 on DNA with solid-state nanopores, Nanoletters, 2018, 18.10: 6469-6474.
Shoji K., et al., Anal Chem, 2020, 92, 10856-10862
Kawano R., et al., Sci Rep. 2013, 3, 1995
Varongchayakul, N., et al., Chem Soc Rev. 2018, 26, 8512-8524
Moon C.P. and Fleming K. G. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 2011, 108, 10174-10177
Farrand,A. J. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 2010, 107, 4341-4346
Dowd,K.J.et al., PLos pathogens, 2012, 8, e1002787
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、ナノポアセンシングに使用できる、新規のナノポアタンパク質を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明らは、鋭意研究の結果、所定の変異を含むインターメディリシンの変異タンパク質が、野生型インターメディリシンよりも安定性が向上し、または、所望の大きいポアサイズが開く確率が向上することを見出し、このような変異タンパク質は実際にタンパク質の検出に用いられることも発見し、本発明を完成した。
【０００８】
すなわち、本発明は、以下の各発明に関する。
【０００９】
［１］
下記の（１）～（３）の少なくとも１つの変異を含むＣＤＣファミリータンパク質の変異タンパク質である、ナノポアタンパク質。
（１）配列番号１に記載のアミノ酸配列における、下記の（ａ）～（ｇ）のいずれか１つの置換
（ａ）３０２位のアルギニンに相当する位置にあるアミノ酸残基のフェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、アラニン、システイン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン若しくはプロリンへの置換
（ｂ）配列番号４８、５１及び５５に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質を除くＣＤＣファミリータンパク質に対する、２４２位のヒスチジンに相当する位置にあるアミノ酸残基のロイシン、チロシン、トリプトファン、アラニン、システイン、バリン、イソロイシン、メチオニン若しくはプロリンへの置換
（ｃ）配列番号４９、５３及び１５に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質を除くＣＤＣファミリータンパク質に対する、３３４位のトレオニンに相当する位置にあるアミノ酸残基のフェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、アラニン、システイン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン若しくはプロリンへの置換
（ｄ）２４１位のバリンに相当する位置にあるアミノ酸残基のグルタミン酸、アルギニン、ヒスチジン、リジン、アスパラギン酸、グリシン、セリン、トレオニン、アスパラギン若しくはグルタミンへの置換
（ｅ）３１５位のトレオニンに相当する位置にあるアミノ酸残基のフェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、アラニン、システイン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン若しくはプロリンへの置換
（ｆ）３３８位のアスパラギンに相当する位置にあるアミノ酸残基のフェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、アラニン、システイン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン若しくはプロリンへの置換
（ｇ）３３９位のイソロイシンに相当する位置にあるアミノ酸残基のセリン、アルギニン、ヒスチジン、リジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、グリシン、トレオニン、アスパラギン若しくはグルタミンへの置換
（２）配列番号１に記載のアミノ酸配列におけるＮ１７８－Ｈ２００のうち、Ｙ１９６－Ｈ２００を含む５～２３個の連続したアミノ酸、又はＷ５１４－Ｖ５２６のうち、Ｔ５１７－Ｌ５１８を含む２～１３個の連続したアミノ酸に相当する位置にあるアミノ酸残基が欠失する変異
（３）配列番号１に記載のアミノ酸配列のＣ末端に、配列番号１に記載のアミノ酸配列におけるＱ５０８－Ｄ５３２のうち、Ｔ５１７－Ｌ５１８を含む２～２５個の連続したアミノ酸残基に相当する位置にあるアミノ酸残基を挿入する変異、又は、配列番号１に記載のアミノ酸配列のＬ５０３とＰ５０４に相当する位置にあるアミノ酸残基の間に、配列番号１に記載のアミノ酸配列におけるＲ４８０－Ｌ５０３のうちＲ４９５を含む１～２４個の連続したアミノ酸残基に相当する位置にあるアミノ酸残基を挿入する変異
［２］
配列番号１に記載のアミノ酸配列におけるＲ３０２、Ｈ２４２、Ｔ３３４、Ｖ２４１、Ｔ３１５、Ｎ３３８又はＩ３３９に相当する位置にあるアミノ酸残基が、Ｒ３０２Ｆ、Ｒ３０２Ｍ、Ｒ３０２Ｌ、Ｒ３０２Ｉ、Ｈ２４２Ｌ、Ｈ２４２Ｉ、Ｈ２４２Ｙ、Ｔ３３４Ｖ、Ｔ３３４Ｉ、Ｖ２４１Ｔ、Ｖ２４１Ｓ、Ｖ２４１Ｋ、Ｖ２４１Ｅ、Ｔ３１５Ｖ、Ｔ３１５Ｉ、Ｎ３３８Ｌ、Ｎ３３８Ｆ、Ｉ３３９Ｔ、Ｉ３３９Ｓ又はＩ３３９Ｋへの置換による変異を含む、［１］に記載のナノポアタンパク質。
［３］
配列番号１に記載のアミノ酸配列におけるＲ３０２、Ｈ２４２、Ｔ３３４、Ｖ２４１、Ｔ３１５又はＩ３３９に相当する位置にあるアミノ酸残基が、Ｒ３０２Ｆ、Ｈ２４２Ｌ、Ｈ２４２Ｉ、Ｈ２４２Ｙ、Ｔ３３４Ｖ、Ｔ３３４Ｉ、Ｖ２４１Ｅ、Ｔ３１５Ｖ、Ｔ３１５Ｉ又はＩ３３９Ｓへの置換による変異を含む、［２］に記載のナノポアタンパク質。
［４］
［１］～［３］のいずれかに記載のナノポアタンパク質を含む、ナノポアセンサー。
［５］
［１］～［２］のいずれかに記載のナノポアタンパク質、又は、［４］に記載のナノポアセンサーを用いた、ナノポアセンシング方法。
［６］
ナノポアタンパク質と、前記ナノポアタンパク質を安定化できる量の界面活性剤を含むナノポアタンパク質懸濁液。
【発明の効果】
【００１０】
本発明のナノポアタンパク質は、オリゴマーを形成しやすいか、及び／又は、大きいサイズのポアを形成しやすいため、ナノポアセンシング系において好適に利用され得る。
【図面の簡単な説明】
（【００１１】以降は省略されています）

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