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公開番号2025018997
公報種別公開特許公報(A)
公開日2025-02-06
出願番号2024117960
出願日2024-07-23
発明の名称抗体模倣分子
出願人京都府公立大学法人,個人
代理人弁理士法人三枝国際特許事務所
主分類C07K 14/78 20060101AFI20250130BHJP(有機化学)
要約【課題】単量体型SOD1に結合する新規な抗体模倣分子を提供する。
【解決手段】ヒト由来フィブロネクチンIII型ドメイン(fibronectin type III domain;FN3)をコードするアミノ酸配列において、少なくとも1個のアミノ酸が変異したアミノ酸配列からなるポリペプチドを含み、単量体型の銅/亜鉛-スーパーオキシドジスムターゼ(Cu/Zn-Superoxide dismutase;SOD1)結合能を有する、抗体模倣分子。
【選択図】なし
特許請求の範囲【請求項１】
ヒト由来フィブロネクチンＩＩＩ型ドメイン（ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｏｎｔｙｐｅＩＩＩｄｏｍａｉｎ；ＦＮ３）をコードするアミノ酸配列において、少なくとも１個のアミノ酸が変異したアミノ酸配列からなるポリペプチドを含み、単量体型の銅／亜鉛－スーパーオキシドジスムターゼ（Ｃｕ／Ｚｎ－Ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅｄｉｓｍｕｔａｓｅ；ＳＯＤ１）結合能を有する、抗体模倣分子。
続きを表示（約 820 文字）【請求項２】
ＦＮ３が６５００ｎＭ以下のＫｄで結合しない単量体型ＳＯＤ１に対して６５００ｎＭ以下のＫｄで結合する、請求項１に記載の抗体模倣分子。
【請求項３】
二量体型ＳＯＤ１に対して６５０μＭ以上のＫｄで結合する、請求項１又は２に記載の抗体模倣分子。
【請求項４】
（ａ）配列番号２で表されるアミノ酸配列
（２３番目のアミノ酸は、Ｄ又はＹであり；
７８番目のアミノ酸は、Ｙ又はＦである。）、又は
（ｂ）配列番号２で表されるアミノ酸配列
（２３番目のアミノ酸は、Ｄ又はＹであり；
７８番目のアミノ酸は、Ｙ又はＦである。）
と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
からなるポリペプチドを含む、請求項１又は２に記載の抗体模倣分子。
【請求項５】
配列番号３～７のいずれかで表されるアミノ酸配列；又は
これらのアミノ酸配列のいずれかと８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
からなるポリペプチドを含む、請求項１又は２に記載の抗体模倣分子。
【請求項６】
配列番号３～７のいずれかで表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを含む、請求項１又は２に記載の抗体模倣分子。
【請求項７】
請求項１又は２に記載の抗体模倣分子を用いて、試料中の単量体型ＳＯＤ１を検出する工程を含む、単量体型ＳＯＤ１の検出方法。
【請求項８】
前記検出工程において、前記抗体模倣分子と前記試料中の単量体型ＳＯＤ１とを架橋する、請求項７に記載の検出方法。
【請求項９】
請求項１又は２に記載の抗体模倣分子を含む、単量体型ＳＯＤ１の検出用キット。
【請求項１０】
請求項１又は２に記載の抗体模倣分子をコードする、核酸分子。
（【請求項１１】以降は省略されています）
発明の詳細な説明【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗体模倣分子に関する。
続きを表示（約 6,700 文字）【背景技術】
【０００２】
スーパーオキシドジスムターゼ（Superoxide dismutase；SOD）は、細胞内で発生した活性酸素の分解を担う酸化還元酵素である。中でも、銅/亜鉛－スーパーオキシドジスムターゼ（Cu/Zn-Superoxide dismutase；SOD1）は、ホモ二量体からなり、各サブユニットには銅イオンと亜鉛イオンが結合している。これらの金属イオンは構造安定化に寄与すると共に、銅イオンは酸化還元反応の触媒中心として働く。
【０００３】
これまでの研究から、家族性筋萎縮性側索硬化症（amyotrophic lateral sclerosis；ALS）の一部患者において、ミスフォールドしたSOD1の脊髄運動ニューロンへの蓄積が報告されている。その発症機序は不明な部分を多く残すが、酸化ストレスや金属イオンの解離を引き金とし、安定な二量体から凝集し易い単量体への構造変化を介してALSが発症するという説が有力視されている。このような背景から、ALSの病態解明への貢献ならびに診断用ツールへの応用を期待し、単量体型SOD1を認識するプローブの開発が望まれている。
【０００４】
現在、単量体型SOD1はSOD1の二量体接合界面配列に対するペプチドポリクローナル抗体であるSEDI抗体により検出可能だが、ロット間差による低再現性の問題を抱える。更に、構造形成にジスルフィド結合（S-S結合）を必須とする抗体ならではの問題として、還元環境下である細胞内での利用はできない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、単量体型SOD1に結合する新規な抗体模倣分子を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、上記課題を解決すべく、鋭意検討を行ったところ、単量体型SOD1結合能を有する新規な抗体模倣分子（monobody）の開発に成功した。本発明はかかる知見に基づいてさらに検討を加えることにより完成したものであり、以下の態様を含む。
【０００７】
項１．
ヒト由来フィブロネクチンＩＩＩ型ドメイン（ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｏｎｔｙｐｅＩＩＩｄｏｍａｉｎ；ＦＮ３）をコードするアミノ酸配列において、少なくとも１個のアミノ酸が変異したアミノ酸配列からなるポリペプチドを含み、単量体型の銅／亜鉛－スーパーオキシドジスムターゼ（Ｃｕ／Ｚｎ－Ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅｄｉｓｍｕｔａｓｅ；ＳＯＤ１）結合能を有する、抗体模倣分子。
項２．
ＦＮ３が６５００ｎＭ以下のＫｄで結合しない単量体型ＳＯＤ１に対して６５００ｎＭ以下のＫｄで結合する、項１に記載の抗体模倣分子。
項３．
二量体型ＳＯＤ１に対して６５０μＭ以上のＫｄで結合する、項１又は２に記載の抗体模倣分子。
項４．
（ａ）配列番号２で表されるアミノ酸配列
（２３番目のアミノ酸は、Ｄ又はＹであり；
７８番目のアミノ酸は、Ｙ又はＦである。）、又は
（ｂ）配列番号２で表されるアミノ酸配列
（２３番目のアミノ酸は、Ｄ又はＹであり；
７８番目のアミノ酸は、Ｙ又はＦである。）
と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
からなるポリペプチドを含む、項１～３のいずれかに記載の抗体模倣分子。
項５．
配列番号３～７のいずれかで表されるアミノ酸配列；又は
これらのアミノ酸配列のいずれかと８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
からなるポリペプチドを含む、項１～４のいずれかに記載の抗体模倣分子。
項６．
配列番号３～７のいずれかで表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを含む、項１～５のいずれかに記載の抗体模倣分子。
項７．
項１～６のいずれかに記載の抗体模倣分子を用いて、試料中の単量体型ＳＯＤ１を検出する工程を含む、単量体型ＳＯＤ１の検出方法。
項８．
前記検出工程において、前記抗体模倣分子と前記試料中の単量体型ＳＯＤ１とを架橋する、項７に記載の検出方法。
項９．
項１～６のいずれかに記載の抗体模倣分子を含む、単量体型ＳＯＤ１の検出用キット。項１０．
項１～６のいずれかに記載の抗体模倣分子をコードする、核酸分子。
項１１．
項１０に記載の核酸分子を含む、発現ベクター。
項１２．
項１０に記載の核酸分子を含む、核酸ライブラリー。
項１３．
項１２に記載の核酸ライブラリーに由来する、ペプチドディスプレイライブラリー。項１４．
ＦＮ３をコードするアミノ酸配列において、少なくとも１個のアミノ酸が変異したアミノ酸配列からなるポリペプチドを含み、ＦＮ３が６５００ｎＭ以下のＫｄで結合しない単量体型ＳＯＤ１に対して６５００ｎＭ以下のＫｄで結合する、抗体模倣分子の製造方法であって、
（１）ＦＮ３をコードするアミノ酸配列において少なくとも１個のアミノ酸が変異したアミノ酸配列からなるポリペプチドのディスプレイライブラリーを構成するポリペプチドをコードする核酸上でＤＮＡシャッフリングを実行することによりポリペプチドのディスプレイライブラリーを得る工程、
（２）前記工程（１）で得られたポリペプチドのディスプレイライブラリーに単量体型ＳＯＤ１を接触させ、１００００ｎＭ以下のＫｄで単量体型ＳＯＤ１に結合する少なくとも１種のポリペプチドを、前記抗体模倣分子として選別する工程、及び
（３）前記工程（２）で選別された少なくとも１種のポリペプチドをコードするアミノ酸配列においてさらに少なくとも１個のアミノ酸が変異したアミノ酸配列からなるポリペプチドのディスプレイライブラリーに単量体型ＳＯＤ１を接触させ、６５００ｎＭ以下のＫｄで単量体型ＳＯＤ１に結合する少なくとも１種のポリペプチドを、前記抗体模倣分子として選別する工程
を含む、製造方法。
項１５．
項１４に記載の製造方法により、得られうる抗体模倣分子。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、単量体型SOD1に結合する新規な抗体模倣分子を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
2種類のSOD1変異体（SOD1(MM)及びSOD1(FG)）の立体構造及び変異箇所を示す図である。
2種類のSOD1変異体（SOD1(MM)及びSOD1(FG)）についてサイズ排除クロマトグラフ-多角度光散乱検出システム（Size Exclusion Chromatograph-Multiple Angle Light Scattering System；SEC-MALS）を用いて分析した結果を示す図である。SOD1タンパク質（50 μM）を流量（flow rate）0.5 mL/minでHPLC系（Prominence、島津製作所製）に注入し、ゲルろ過カラム（TSKgel G2000SW、東ソー株式会社製）を用いてMNバッファー中で分離した。溶出液の絶対モル質量は、HPLC系の下流に設置された多角度静的光散乱検出器（miniDAWN TREOS、WYATT Technology社製）を用いて推定した。（Ａ）E,E-SOD1は金属イオン（銅イオンと亜鉛イオン）を欠くSOD1であり、これら金属イオンの非存在下で上記実験を行ったことを意味する。ランニングバッファーとして、5 mM EDTAを含むMNバッファーを用いた。（Ｂ）E,E-SOD1＋Zn
2+
はMNバッファー中でE,E-SOD1と等量のZnSO
4
を37℃で30分間インキュベート後、上記実験に供したことを意味する。（Ｃ）E,E-SOD1＋Cu
2+
はMNバッファー中でE,E-SOD1と等量のCuSO
4
を37℃で30分間インキュベート後、上記実験に供したことを意味する。
monobody sideライブラリーのアミノ酸配列及び構造を示す図である。
monobody sideライブラリー（Ａ）を用いたセレクションにより得られた抗体模倣分子（Mb(S1)、Mb(S2)、Mb(S3)、及びMb(S4)）のアミノ酸配列（Ｂ）及び単量体型又は二量体型SOD1に対する結合特性（Ｃ及びＤ）を示す図である。単量体型又は二量体型SOD1に対する結合特性は、以前の報告（[Tanaka, S.-i. et al., Monobody-mediated alteration of enzyme specificity. Nat. Chem. Biol. 11 (2015) 762-764.]、及び[Tanaka, S.-i. et al., Monobody-mediated alteration of lipase substrate specificity. ACS Chem. Biol. 13 (2018) 1487-1492.]）と同様に、酵母表面ディスプレイ法を用いて評価した。Kd値は、SigmaPlotソフトウェア（Systat Software社製）を用いて1:1結合モデルを当てはめ、SOD1濃度に対する蛍光強度の中央値のプロットから求めた。
Mb(S4)又はMb(S2)とSOD1タンパク質（SOD1(MM)（Ａ、Ｄ）、SOD1(WT)（Ｂ、Ｅ）、及びSOD1(FG)（Ｃ、Ｆ））の相互作用についてBLItz装置（Sartorius社製）を用いたバイオレイヤー干渉法（bio layer interferometry；BLI）により解析した結果を示す図である。ストレプトアビジンでコーティングしたバイオセンサーを、50 mM Tris、150 mM NaCl、0.02% Tween（登録商標）20を含むBLIアッセイバッファー（pH 7.4）に少なくとも10分間浸した。アポ状態のSOD1タンパク質を分析するため、BLIアッセイバッファーにはさらに1 mM EDTAを加えた。バイオセンサーをBLItz装置にセットし、5μM Mb(S4)を含むBLIアッセイバッファーに120秒間浸し、BLIアッセイバッファーで60秒間洗浄した。結合アッセイは、BLIアッセイバッファーを用いた最初のベースラインステップ（60秒）、BLIアッセイバッファーに20、50、又は100 μMのSOD1を加えた結合ステップ（120秒）、BLIアッセイバッファーを用いた解離ステップ（120秒）の3ステップからなる。解離定数(Kd)、会合速度定数(ka)、解離速度定数(kd)は、BLItz Proソフトウェアバージョン1.2を用いて、観測されたセンサーグラムを1:1結合モデルにグローバルにフィッティングすることにより推定した。
化学架橋がMb(S4)と単量体型SOD1との複合体の検出安定性を向上させることを示す図である。SOD1タンパク質（15 μM）をMNバッファー中で15 μM Mb(S4)と混合し、これに水に溶解した架橋剤DSG（Disuccinimidyl glutarate、Thermo Fisher Scientific製）又はBS3（Bis(sulfosuccinimidyl)suberate disodium salt、株式会社同仁化学研究所製）を加えた（最終濃度 1 mM）。室温で30分間インキュベートした後、1M Tris（pH8）を加え（Trisの最終濃度、50mM）、架橋反応を停止させた。このサンプルをさらにβ-メルカプトエタノールを含むLaemmliサンプルバッファーと混合し、12.5%ポリアクリルアミドゲルを用いてSDS-PAGEで分析した。ゲルをCoomassie Brilliant Blue R-250で染色した。
SOD1タンパク質を発現する大腸菌溶解物又は酵母溶解物を用いた、Mb(S4)による単量体型SOD1の検出結果を示す図である。SOD1タンパク質を発現する大腸菌溶解物又は酵母溶解物（全タンパク質10 μg）をMNバッファー中で15 μM Mb(S4)と混合し、上記と同様の方法で化学架橋後、SDS-PAGE分析した。SDS-PAGEでゲル上に分離したタンパク質をPVDF膜にエレクトロブロッティングし、SOD1に対するポリクローナル抗体（#GTX100554、GeneTex社製）を用いてウェスタンブロッティング法により調べた。
Mb(S4)を用いた単量体型SOD1のELISA検出用キットの模式図（Ａ）及び当該キットの、SOD1タンパク質（SOD1(WT)、SOD1(MM)、及びSOD1(FG)）に対する反応性を示す図（Ｂ）である。リコンビナントSOD1タンパク質（0.01～1.0 μM）をMNバッファー中でMb(S4)と混合した。最終濃度が1 mMになるようにBS3を添加し、室温で30分間インキュベートした後、Trisを最終濃度50 mMになるまで加えて反応を停止させた。この混合物をPierce（登録商標）NeutrAvidin（登録商標）コーティング高容量プレート（Thermo Scientific製）のウェルに供し、洗浄バッファー（150 mM NaClを含む25 mM Tris(pH7.2)、0.1% BSA及び0.05% Tween（登録商標）20）で予洗した。1時間インキュベーション後、ウェルを洗浄バッファーで洗浄し、洗浄バッファーで300倍に希釈したポリクローナル抗SOD1抗体（#GTX100554、GeneTex社製）を用いて30分間インキュベートした。その後、洗浄バッファーでウェルを洗浄し、洗浄バッファーで300倍に希釈したヤギ抗ウサギIgG(H+L)二次抗体（#32460、Invitrogen製）を用いて30分間インキュベートした。ウェルを洗浄バッファーで洗浄し、基質溶液（0.4 g/L o-フェニレンジアミン及び0.012% H
2
O
2
を含む100 mM クエン酸ナトリウム(pH5.0)）を加えた。塩化水素を添加して反応を停止させ、プレートリーダーEpoch（BioTek製）を用いて490 nmにおける吸光度を測定した。
上段は、Neuro2aライセート中の単量体SOD1の検出結果 Mb(S4)を用いたウエスタンブロット結果を示す写真である。中段は、Mb(sh)を用いたウエスタンブロット結果を示す写真である。下段は、細胞ライセート中のSOD1のチオールジスルフィド状態を示す写真である。実験は少なくとも2回繰り返され、再現性のある結果が得られた。Mb(sh)はSOD1と非結合Mb(ネガティブコントロール)を表す。
酵母表層ディスプレイ法とFACSを用いたMb(S4_Y53S/Y54K) とMb(MMcAvi_03)）のSO1(FG)に対する親和性解析結果を示す図である。
BLIを用いたMb(MMcAvi_03)、Mb(FG_03)の単量体SOD1に対する特異性解析結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
１．本発明の抗体模倣分子
本発明の抗体模倣分子は、ヒト由来フィブロネクチンIII型ドメイン（fibronectin type III domain；FN3）（本明細書中においてヒト由来FN3を「hFN3」と記載することがある）をコードするアミノ酸配列において、少なくとも1個のアミノ酸が変異したアミノ酸配列からなるポリペプチドを含み、単量体型の銅/亜鉛－スーパーオキシドジスムターゼ（Cu/Zn-Superoxide dismutase；SOD1）結合能を有する。
（【００１１】以降は省略されています）

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