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公開番号2025022436
公報種別公開特許公報(A)
公開日2025-02-14
出願番号2023127003
出願日2023-08-03
発明の名称アシアロGM1に結合活性を有するウサギモノクローナル抗体
出願人ヤマサ醤油株式会社
代理人
主分類C07K 16/28 20060101AFI20250206BHJP(有機化学)
要約【課題】マウス・ラットへの投与により、in vivoで確実にNK活性を低下させることができる抗ASGM1モノクローナル抗体および/または、NK細胞を検出するための免疫学的アッセイに有用なIgG型の抗ASGM1モノクローナル抗体を得る。
【解決手段】ASGM1を免疫した齧歯目に属さない動物のリンパ球からモノクローナル抗体を作製することにより、マウスに投与した際、in vivoで強いNK活性抑制作用を示すIgG型のウサギ抗ASGM1モノクローナル抗体を、きわめて高い効率で取得することができる。
【選択図】なし
特許請求の範囲【請求項１】
アシアロＧＭ１に結合活性を有し、かつ齧歯目に属さない動物に由来するモノクローナル抗体。
続きを表示（約 730 文字）【請求項２】
齧歯目に属さない動物がウサギである、請求項１に記載のモノクローナル抗体。
【請求項３】
ＩｇＧモノクローナル抗体である、請求項１または２に記載のモノクローナル抗体。
【請求項４】
マウスまたはラットに投与したとき、ＮＫ活性抑制作用を示す、請求項１記載の抗アシアロＧＭ１モノクローナル抗体。
【請求項５】
マウスに１００μｇ／匹を投与したとき、投与３日後の脾細胞のＮＫ活性が、投与なしコントロールの２０％以下となる、請求項４記載のモノクローナル抗体。
【請求項６】
マウスに２０μｇ／匹を投与したとき、投与３日後の脾細胞のＮＫ活性が、投与なしコントロールの２０％以下となる、請求項４記載のモノクローナル抗体。
【請求項７】
マウスに４μｇ／匹を投与したとき、投与３日後の脾細胞のＮＫ活性が投与なしコントロールの２０％以下となる、請求項４記載のモノクローナル抗体。
【請求項８】
ＡＳＧＭ１と反応し、ＡＳＧＭ２，ＡＳＧＭ３，ＧＭ２，ＧＭ３，ＧＤ１ａおよびＧＤ１ｂと実質的に反応しない、請求項１から請求項７のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体。
【請求項９】
ＡＳＧＭ１と反応し、ＡＳＧＭ２，ＡＳＧＭ３，ＧＭ１，ＧＭ２，ＧＭ３，ＧＤ１ａおよびＧＤ１ｂと実質的に反応しない、請求項１から請求項７のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体。
【請求項１０】
請求項１から請求項９のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体を投与することによる、マウスまたはラットのＮＫ活性を抑制する方法。
（【請求項１１】以降は省略されています）
発明の詳細な説明【技術分野】
【０００１】
本発明は、アシアロＧＭ１（以下、「ＡＳＧＭ１」と記載する場合がある）に反応性を有するウサギモノクローナル抗体、並びにマウス・ラットに投与した際にｉｎｖｉｖｏで強いＮＫ活性抑制作用を有する抗ＡＳＧＭ１モノクローナル抗体、および当該抗体の取得方法に関する。
続きを表示（約 1,700 文字）【背景技術】
【０００２】
ナチュラルキラー細胞（以下、「ＮＫ細胞」と記載する場合がある）は自然免疫に関与しており、ウイルス感染細胞やがん細胞の除去に重要な役割を担っている。ＮＫ細胞は、事前の免疫なしに、様々ながん細胞を自発的に攻撃することができる。
【０００３】
ＡＳＧＭ１はマウス・ラットのＮＫ細胞表面などに存在する糖脂質であり、ＮＫ細胞のマーカーとされている。従来、ＡＳＧＭ１に対するウサギ抗血清やポリクローナル抗体が取得され、フローサイトメトリー、免疫組織化学的検査などの免疫学的手法によるＮＫ細胞の検出アッセイに使用されている。
【０００４】
また、当該ＡＳＧＭ１に対する抗血清やポリクローナル抗体は、マウス・ラットに対しＮＫ活性抑制作用を有することが知られている。「ＮＫ活性」とは、ＮＫ細胞が有する細胞障害活性のことを指し、その活性の値は、ＮＫ細胞と、ＹＡＣ－１細胞のようなＮＫ細胞の標的細胞を同居させ、あらかじめ放射性物質などで標識しておいた標的細胞から遊離する標識物質を定量したり、障害された標的細胞から漏出した乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）の活性を測定したりすること等により、測定することができる。
【０００５】
例えば、ＳＣＩＤマウスなどの免疫不全マウスにおいて、異種の臓器やがん細胞を移植した際には、ＮＫ活性によって、当該移植した臓器や細胞の定着率が低下してしまうが、抗ＡＳＧＭ１ウサギ抗血清をこれらのマウスに投与すると、ＮＫ活性が抑制され、定着率が向上する。このことなどから、ＡＳＧＭ１に対するウサギ抗血清やポリクローナル抗体は、ＮＫ細胞研究やモデル動物におけるＮＫ活性抑制などに用いられてきた。
【０００６】
こうしたアッセイやＮＫ細胞研究には、従来ＡＳＧＭ１に対するウサギ抗血清やポリクローナル抗体が用いられてきた。しかしながら、抗血清やポリクローナル抗体は、ＡＳＧＭ１以外にも、モノシアロガングリオシド（ＧＭ１）など関連した分子構造を持つ糖脂質への交差反応がみられるだけでなく、抗体のロット間差が存在するなどの問題があり、製造・供給の継続性にも不安があった。
【０００７】
一方、上記課題を解決すべく、主にマウスを使用したＮＫ活性抑制作用を持つ抗ＡＳＧＭ１モノクローナル抗体の作製が試みられてきた。
【０００８】
しかしながら、マウスやラットでは、ＡＳＧＭ１は正常の組織および細胞表面に元来存在するため、マウス・ラットにとってＡＳＧＭ１は自己抗原であり、これらの動物から結合力の高いＩｇＧ型抗ＡＳＧＭ１抗体は得ることができなかった。したがって、従来の抗ＡＳＧＭ１モノクローナル抗体は、ＩｇＧ型ではなく、マウスＩｇＭに限られていた。一般にＩｇＭ型抗体は、ＩｇＧ型抗体と比べてアフィニティが低いことから、ＡＳＧＭ１の検出においては、ＩｇＧ型モノクローナル抗体が存在しないことも課題となっていた。また下記に詳述するように、これらの従来取得されたＩｇＭ型抗ＡＳＧＭ１マウスモノクローナル抗体は、実際にマウス・ラットに投与してＮＫ活性抑制作用を示すものとは言えなかった。
【０００９】
従来、抗ＡＳＧＭ１マウスモノクローナル抗体を取得した例として、ＡＳＧＭ１を免疫した自己免疫マウスから作製したＩｇＭモノクローナル抗体がある（特許文献１）。特許文献１には、得られた抗体４クローンをｉｎｖｉｔｒｏで補体と共にマウス脾細胞に作用させた場合、脾細胞のを無処理細胞の７５－３８％までしか低下させることができなかったと記載されている。
【００１０】
また、同じグループからの報告では、ＡＳＧＭ１を免疫した自己抗体マウスから５クローンのＩｇＭモノクローナル抗体を作製し、ｉｎｖｉｔｒｏの実験系で当該抗体を補体と共に作用させたところ、腹水３倍希釈（この腹水中の抗体濃度は１．０－１．９ｍｇ／ｍＬと記載されているので、３３３－６３３μｇ／ｍＬに相当する）でコントロールの最大２６．２％までしか低下させることができなかったと報告されている。（非特許文献１）
（【００１１】以降は省略されています）

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