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公開番号2024177015
公報種別公開特許公報(A)
公開日2024-12-19
出願番号2023154059
出願日2023-09-21
発明の名称椎間板由来の髄核細胞の拡大培養方法及びその用途
出願人精準再生生醫股分有限公司
代理人個人
主分類C12N 5/071 20100101AFI20241212BHJP(生化学;ビール;酒精;ぶどう酒;酢;微生物学;酵素学;突然変異または遺伝子工学)
要約【課題】椎間板由来の髄核細胞の拡大培養方法及びその用途を提供する。
【解決手段】本発明は、主に椎間板から髄核細胞を取得すると共に、体外で拡大培養する方法が開示される。本発明は、上記の方法により得られる髄核細胞を用いて、下背部痛を治療する医薬組成物を製造するための用途を提供することを副次的な目的とし、前記髄核細胞を含有する医薬組成物の応用を経て、慢性下背部痛を治療するために用いられる。
【選択図】図6
特許請求の範囲【請求項１】
椎間板由来の髄核細胞を体外で拡大培養する方法であって、
ａ）髄核組織（ｎｕｃｌｅｕｓｐｕｌｐｏｓｕｓ）を提供する工程と、ｂ）前記髄核組織を酵素で加水分解すると共に、加水分解されていない前記髄核組織と初代髄核細胞とを篩い分け手段及び遠心分離手段により分離する工程と、ｃ）前記工程ｂ）にて得られる当該初代髄核細胞について初代培養を行う工程と、ｄ）前記工程ｃ）にて初代培養を行った当該初代髄核細胞が所定の細胞密度に達した後、当該初代髄核細胞を取り出して継代培養を行う工程と、ｅ）１個または多数個の遺伝子の発現量に基づいて、前記工程ｄ）にて継代培養を行った当該初代髄核細胞中から髄核細胞を選別する工程と、ｆ）前記工程ｅ）にて得られる当該髄核細胞について拡大培養を行う工程とを含み、当該１個または多数個の遺伝子は、髄核発生遺伝子、軟骨分化遺伝子、髄核特異的な遺伝子、髄核退行変性遺伝子及び線維輪特異的な遺伝子よりなる遺伝子モジュール中から選択される遺伝子であることを特徴とする、椎間板由来の髄核細胞を体外で拡大培養する方法。
続きを表示（約 690 文字）【請求項２】
前記髄核発生遺伝子は、ＫＤＭ４Ｅであることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記軟骨分化遺伝子は、ＳＯＸ９と、ＣＯＬ２Ａ１と、Ａｇｃ１とを含むことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記髄核特異的な遺伝子は、ＰＡＸ１であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記髄核退行変性遺伝子は、ＳＡＡ１であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記線維輪特異的な遺伝子は、ＣＤ９０であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記髄核組織を加水分解するための前記酵素は、コラゲナーゼ、トリプシンまたはこれらの組み合せであることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記細胞密度は、８０～９０％の細胞密度であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
当該遺伝子の発現量は、定量ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）、ノーザンブロッティング法（Ｎｏｒｔｈｅｒｎｂｌｏｔｔｉｎｇ）、ウェスタンブロッティング法（ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｔｉｎｇ）またはＤＮＡマイクロアレイ（ＤＮＡｍｉｃｒｏａｒｒａｙ）により検出測定されることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
請求項１に記載の方法により得られる前記髄核細胞から、下背部痛を治療する医薬組成物を製造するための用途であることを特徴とする、方法の用途。

発明の詳細な説明【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞拡大培養方法の技術分野に係り、特に、椎間板由来の髄核細胞の拡大培養方法及びその用途の技術分野に関するものである。
続きを表示（約 2,500 文字）【背景技術】
【０００２】
椎間板組織（Ｉｎｔｅｒｖｅｒｔｅｂｒａｌｄｉｓｃ）は、椎骨（Ｖｅｒｔｅｂｒａ）の間に位置しており、線維輪（Ａｎｎｕｌｕｓｆｉｂｒｏｓｕｓ）と、髄核組織（Ｎｕｃｌｅｕｓｐｕｌｐｏｕｓ）とから構成され、椎体間の動きによって生じる摩擦を緩衝することができる。椎間板退行変性症（Ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅｄｄｉｓｃｄｉｓｅａｓｅ）は、下背部痛（Ｌｏｗｂａｃｋｐａｉｎ）などの症状を引き起こすことが多く、年齢が３０～５０歳代の成人個体に好発し、症状が重い方では、椎間板の崩壊が起こることもある。統計によると、８０％の成人が一生のうちに下背部痛を経験すると言われており、その中でも約４分の１の人が、長引く背部痛によって仕事に支障をきたしてしまう。
【０００３】
一般に、椎間板退行変性症の初期症状が現われる時期に、初めは臨床医師が処方する鎮痛薬物を患者に渡し、服用してもらうことで、生理的な疼痛を一時的に軽減することができる。現在、よく用いられている薬物は、非ステロイド性消炎鎮痛薬（ＮＳＡＩＤ）、アセトアミノフェン（Ａｃｅｔａｍｉｎｏｐｈｅｎ）、ステロイド系薬物などを含む。これらの種類の薬物は、細胞の分泌バランスが乱れてしまう場合があると共に、胃や腸などの消化器系の副作用を起こすおそれがある。椎間板退行変性の症状が重い人では、椎間板置換術を行う治療の必要はあるものの、人工椎間板インプラントのその材質は、高分子ポリマーと金属物質を混ぜ合せたものであり、かつ生体適合性がないため、より一層深刻な副作用が起こりやすい。上記で述べたような方法は、いずれも直接退行変性に陥った椎間板に対して治療を行うことができず、かつ患者の生活の質の向上に向けての顕著な改善も見られない。
【０００４】
椎間板構造に損傷または退行変性が発生する時に、髄核組織は、不安定になる可能性があると共に、かかる負荷や圧力が増大することが原因で、外側に突出するか、さらにひどくなると、線維輪を突き破って外に飛び出すこともある。このように突出した髄核組織が、例えば、脊髄や神経根のような周囲の神経構造を圧迫することにより、疼痛、放散通、麻痺や筋無力などの症状を引き起こす。このため、椎間板突出と髄核組織の位置及び圧力との間に密接な関係が存在している。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本願の発明者は、現今の椎間板退行変性症の治療方式の制限及び欠点、並びに椎間板退行変性と髄核組織との間に基づく関係に鑑み、そのために本願の発明者は、椎間板退行変性の初期に、患者の椎間板の髄核組織中から髄核細胞を取得すると共に、体外で拡大培養した後にそれを凍結保存でき、患者からの要望があれば、次にそれを解凍した後に再培養すると共に、患者の患部に植え込むことで、それを患者の患部で成長させるため、免疫拒絶反応が生じることはないことから、髄核組織の再生及び椎間板退行変性の治療という目的を達成することが望まれている。このため、本願の発明者は、極力研究発明した結果、遂に本発明に係る椎間板由来の髄核細胞を体外で拡大培養する方法及び前述した方法により得られる髄核細胞から下背部痛を治療する医薬組成物を製造するための用途を研究開発して完了させた。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明の主要な目的は、椎間板由来の髄核細胞を体外で拡大培養する方法を提供することであり、それは、ａ）髄核組織（ｎｕｃｌｅｕｓｐｕｌｐｏｓｕｓ）を提供する工程と、ｂ）前記髄核組織を酵素で加水分解すると共に、加水分解されていない前記髄核組織と組織から脱落する初代髄核細胞とを篩い分け手段及び遠心分離手段により分離する工程と、ｃ）前記工程ｂ）にて得られる当該初代髄核細胞について初代培養を行う工程と、ｄ）前記工程ｃ）にて初代培養を行った当該初代髄核細胞が所定の細胞密度に達した後、当該初代髄核細胞を取り出して継代培養を行う工程と、ｅ）１個または多数個の遺伝子の発現量に基づいて、前記工程ｄ）にて継代培養を行った当該初代髄核細胞中から髄核細胞を選別する工程と、ｆ）前記工程ｅ）にて得られる当該髄核細胞について拡大培養を行う工程とを含み、その内、当該１個または多数個の遺伝子は、髄核発生遺伝子、軟骨分化遺伝子、髄核特異的な遺伝子、髄核退行変性遺伝子及び線維輪特異的な遺伝子よりなる遺伝子モジュール中から選択される遺伝子である。
【０００７】
上記の方法において、前記髄核発生遺伝子は、ＫＤＭ４Ｅであり、前記軟骨分化遺伝子は、ＳＯＸ９と、ＣＯＬ２Ａ１と、Ａｇｃ１とを含み、前記髄核特異的な遺伝子は、ＰＡＸ１であり、前記髄核退行変性遺伝子は、ＳＡＡ１であり、及び前記線維輪特異的な遺伝子は、ＣＤ９０である。
【０００８】
このほか、上記の方法において、前記髄核組織を加水分解するための前記酵素は、コラゲナーゼ（ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ）、トリプシン（ｔｒｙｐｓｉｎ）またはこれらの組み合せであり、なおかつ工程ｃ）にて初代培養を行った当該初代髄核細胞が、０～１４日間経過後、５０～１００％の細胞密度に達した後、より好ましくは５～７日間経過後、８０～９０％の細胞密度に達した後、当該初代髄核細胞を取り出して継代培養を行う。
【０００９】
さらに、上記の方法において、当該遺伝子の発現量は、定量ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）、ノーザンブロッティング法（Ｎｏｒｔｈｅｒｎｂｌｏｔｔｉｎｇ）、ウェスタンブロッティング法（Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｔｉｎｇ）またはＤＮＡマイクロアレイ（ＤＮＡｍｉｃｒｏａｒｒａｙ）により検出測定される。
【００１０】
同時に、本発明の副次的な目的は、上記の方法により得られる髄核細胞を用いて、下背部痛を治療する医薬組成物を製造するための用途を提供することであり、その内、前記医薬組成物は、医薬学上許容され得る担体を含む。
【発明の効果】
（【００１１】以降は省略されています）

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