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公開番号2024163248
公報種別公開特許公報(A)
公開日2024-11-21
出願番号2024152139,2022179310
出願日2024-09-04,2018-02-02
発明の名称RNAの製造方法
出願人味の素株式会社
代理人弁理士法人秀和特許事務所
主分類C12N 15/10 20060101AFI20241114BHJP(生化学;ビール;酒精;ぶどう酒;酢;微生物学;酵素学;突然変異または遺伝子工学)
要約【課題】RNAの製造方法を提供する。
【解決手段】リボヌクレアーゼIIIの活性が低下するように改変された、目的RNAの発現ユニットを有するコリネ型細菌を培地で培養し、目的RNAを発現させ、該細菌の菌体内に目
的RNAを蓄積すること、および前記菌体より目的RNAを採取することにより、目的RNAを製
造する。
【選択図】なし
特許請求の範囲【請求項１】
目的RNAの製造方法であって、
目的RNAの発現ユニットを有するコリネ型細菌を培地で培養し、目的RNAを発現させ、該細菌の菌体内に目的RNAを蓄積すること、および
前記菌体より目的RNAを採取すること、
を含み、
前記細菌が、非改変株と比較して、リボヌクレアーゼIIIの活性が低下するように改変
されている、方法。

発明の詳細な説明【技術分野】
【０００１】
本発明は、微生物を用いた発酵法によるRNA（リボ核酸）の製造方法に関する。
続きを表示（約 4,000 文字）【背景技術】
【０００２】
微生物を利用したRNAの製造法としては、例えば、リボヌクレアーゼIII（RNaseIII）を欠損したエシェリヒア・コリ（Escherichia coli）を宿主として、菌体内にRNAを蓄積す
る方法（非特許文献１）、φ６バクテリオファージの機能を利用し、シュードモナス・シリンガエ（Pseudomonas syringae）を宿主として、キャプシド内にRNAを蓄積する方法（
非特許文献２）、Escherichia coliを宿主として、tRNAの部分配列を融合したRNAを菌体
内に蓄積する方法（非特許文献３）、Escherichia coliを宿主として、siRNAをそれと結
合するタンパク質と複合体を形成させて製造する方法（非特許文献４）、ロドブルム属（Rhodovulum）細菌を宿主として、RNAを分泌生産する方法（特許文献１）、酵母を宿主と
して、酵母ミトコンドリア内にRNAを蓄積する方法（特許文献２）が知られている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
WO2009/063969
WO2010/084371
【非特許文献】
【０００４】
Tenllado F, et. al., Crude extracts of bacterially expressed dsRNA can be used to protect plants against virus infections. BMC Biotechnol. 2003 Mar 20;3:3.
Aalto AP, et. al., Large-scale production of dsRNA and siRNA pools for RNA interference utilizing bacteriophage phi6 RNA-dependent RNA polymerase. RNA. 2007 Mar;13(3):422-9.
Ponchon L, et. al., A generic protocol for the expression and purification of recombinant RNA in Escherichia coli using a tRNA scaffold. Nat Protoc. 2009;4(6):947-59.
Huang L, et. al., Efficient and specific gene knockdown by small interfering RNAs produced in bacteria. Nat Biotechnol. 2013 Apr;31(4):350-6.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、効率的なRNAの製造方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、リボヌクレアーゼIII（RNaseIII）を欠損したコリネ型細菌でRNAを発現させることにより、RNAを効率的に製造できることを見出し、本発明を完成させた。
【０００７】
すなわち、本発明は以下の通り例示できる。
［１］
目的RNAの製造方法であって、
目的RNAの発現ユニットを有するコリネ型細菌を培地で培養し、目的RNAを発現させ、該細菌の菌体内に目的RNAを蓄積すること、および
前記菌体より目的RNAを採取すること、
を含み、
前記細菌が、非改変株と比較して、リボヌクレアーゼIIIの活性が低下するように改変
されている、方法。
［２］
前記リボヌクレアーゼIIIが、下記（ａ）、（ｂ）、または（ｃ）に記載のタンパク質
である、前記方法：
（ａ）配列番号５２に示すアミノ酸配列を含むタンパク質；
（ｂ）配列番号５２に示すアミノ酸配列において、１～１０個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、および／または付加を含むアミノ酸配列を含み、且つ、リボヌクレアーゼIII
活性を有するタンパク質；
（ｃ）配列番号５２に示すアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、且つ、リボヌクレアーゼIII活性を有するタンパク質。
［３］
リボヌクレアーゼIIIをコードする遺伝子の発現を低下させることにより、または該遺
伝子を破壊することにより、リボヌクレアーゼIIIの活性が低下した、前記方法。
［４］
リボヌクレアーゼIIIをコードする遺伝子を欠損させることにより、リボヌクレアーゼIIIの活性が低下した、前記方法。
［５］
前記細菌が、前記発現ユニットを、５コピー／ｃｅｌｌ以上のコピー数で有する、前記方法。
［６］
前記細菌が、前記発現ユニットを、７０コピー／ｃｅｌｌ以上のコピー数で有する、前記方法。
［７］
前記細菌が、前記発現ユニットを含むベクターを有する、前記方法。
［８］
前記発現ユニットが、５’から３’方向に、コリネ型細菌で機能するプロモーター配列および目的RNAをコードする塩基配列を含む、前記方法。
［９］
前記プロモーター配列が、ファージ由来のプロモーターである、前記方法。
［１０］
前記プロモーター配列が、F1プロモーターまたはT7プロモーターである、前記方法。
［１１］
前記プロモーター配列が、下記（ａ）または（ｂ）に記載のプロモーターである、前記方法：
（ａ）配列番号１３または７８に示す塩基配列を含むプロモーター；
（ｂ）配列番号１３または７８に示す塩基配列に対して９０％以上の同一性を有する塩基配列を含むプロモーター。
［１２］
前記細菌が、コリネバクテリウム（Corynebacterium）属細菌である、前記方法。
［１３］
前記細菌が、コリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）である、前記方法。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
プラスミドpPBS4SΔrncの構築手順を示す図。
rnc遺伝子欠損確認のためのアガロースゲル電気泳動図（写真）。
プラスミドpVC7-sacBの構築手順を示す図。
プラスミドpVC7-Pf1-U1Ainsertの構築手順を示す図。
プラスミドの構築手順を示す図。（Ａ）pVC7-Pf1-Hv-iap。（Ｂ）pVC7-Pf1-Hv-iap-Pf1rev。
rnc遺伝子の欠損によるRNA生産量の向上効果を示すアガロースゲル電気泳動図（写真）。
RNA発現用プラスミドの高コピー数化によるRNA生産量の向上効果を示すアガロースゲル電気泳動図（写真）。
プラスミドpL4440-Pt7-U1Ainsertの構築手順を示す図。
プラスミドpL4440-Pt7-Hv-iap-Pt7revの構築手順を示す図。
C. glutamicumでのF1プロモーター発現系とE. coliでのT7プロモーター誘導発現系によるRNA生産量の比較結果を示すアガロースゲル電気泳動図（写真）。
プラスミドpPK4 XB-T7 terの構築手順を示す図。
プラスミドpPK-T7lacの構築手順を示す図。
プラスミドpPK-T7lac-vd-antiOlacの構築手順を示す図。
プラスミドpVC54の構築手順を示す図。
プラスミドpBS5t-ptrB*の構築手順を示す図。
プラスミドpBS5t-ptrB*-2Terの構築手順を示す図。
プラスミドpBS5t-ptrB*-T7polの構築手順を示す図。
プラスミドpVC54-T7polの構築手順を示す図。
C. glutamicumでのT7プロモーター誘導発現系によるRNA生産を示すアガロースゲル電気泳動図（写真）。レーン１～２および６～７：クローンＡ、レーン３～４および８～９：クローンＢ、レーン５：Century-Plus RNA Marker (Ambion AM7145)。
プラスミドpPK4-T7polの構築手順を示す図。
プラスミドpVC7-Pt7-Hv-iap-Pt7revの構築手順を示す図。
C. glutamicumでのT7プロモーター誘導発現系によるRNA生産を示すアガロースゲル電気泳動図（写真）。
高コピー数プラスミドpPK4H1によるRNA生産を示すアガロースゲル電気泳動図（写真）。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１０】
本発明の方法は、目的RNAの発現ユニットを有するコリネ型細菌を培地で培養すること
、および転写された目的RNAを採取すること、を含む目的RNAの製造方法であって、前記細菌がリボヌクレアーゼIIIの活性が低下するように改変されている、方法である。同方法
に用いられるコリネ型細菌を「本発明の細菌」ともいう。
（【００１１】以降は省略されています）

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