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公開番号2024156813
公報種別公開特許公報(A)
公開日2024-11-06
出願番号2024124612,2022136803
出願日2024-07-31,2017-11-21
発明の名称化学組成物とそれを利用する方法
出願人ナノストリングテクノロジーズ,インコーポレイティド
代理人個人,個人,個人,個人,個人,個人
主分類C12Q 1/6876 20180101AFI20241029BHJP(生化学;ビール;酒精;ぶどう酒;酢;微生物学;酵素学;突然変異または遺伝子工学)
要約【課題】酵素なし、増幅なし、ライブラリなしで迅速に実施され、読み出し長が長くてエラー率が低い核酸シークエンシングを提供するシークエンシング用プローブと、レポータプローブと、方法を提供する。
【解決手段】少なくとも6個の二次核酸分子とハイブリダイズする一次核酸分子を含むプローブであって、前記複数の二次核酸分子のそれぞれが、少なくとも5個の三次核酸分子にハイブリダイズしており、前記の三次核酸分子のそれぞれが、少なくとも1個の検出可能な標識を含む、プローブを提供する。
【選択図】なし
特許請求の範囲【請求項１】
標的結合ドメインとバーコードドメインを含むシークエンシング用プローブであって；
前記標的結合ドメインは少なくとも8個のヌクレオチドを含んでいて標的核酸に結合することができ、前記標的結合ドメインの中の少なくとも6個のヌクレオチドは、前記標的核酸分子の中の対応するヌクレオチドを同定することができ、前記標的結合ドメインの中の少なくとも2個のヌクレオチドは、前記標的核酸分子の中の対応するヌクレオチドを同定することがなく；前記標的結合ドメインの中の前記少なくとも6個のヌクレオチドのうちの少なくとも2個のヌクレオチドは、修飾されたヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体であり；
前記バーコードドメインは合成骨格を含んでいて、前記バーコードドメインは少なくとも3つの付着位置を含み、それぞれの付着位置は、相補的核酸分子が結合することのできる少なくとも1つの核酸配列を含む少なくとも1つの付着領域を含み、前記少なくとも3つの付着位置の核酸配列が、前記標的結合ドメインが結合する前記標的核酸の中の前記少なくとも6個のヌクレオチドの位置と属性を決めており、前記少なくとも3つの付着位置のそれぞれは異なる核酸配列を有する、シークエンシング用プローブ。
続きを表示（約 3,800 文字）【請求項２】
標的結合ドメインとバーコードドメインを含むシークエンシング用プローブであって；
前記標的結合ドメインは少なくとも8個のヌクレオチドを含んでいて標的核酸に結合することができ、前記標的結合ドメインの中の少なくとも6個のヌクレオチドは、前記標的核酸分子の中の対応するヌクレオチドを同定することができ、前記標的結合ドメインの中の少なくとも2個のヌクレオチドは、前記標的核酸分子の中の対応するヌクレオチドを同定することがなく；前記標的結合ドメインの中の前記少なくとも6個のヌクレオチドのうちの少なくとも2個のヌクレオチドは、修飾されたヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体であり；
前記バーコードドメインは合成骨格を含んでいて、前記バーコードドメインは少なくとも3つの付着位置を含み、それぞれの付着位置は、相補的核酸分子が結合することのできる少なくとも1つの核酸配列を含む少なくとも1つの付着領域を含み、
前記少なくとも3つの付着位置のそれぞれは、前記標的結合ドメインの中の前記少なくとも6個のヌクレオチドのうちの2個のヌクレオチドに対応するとともに、前記少なくとも3つの付着位置のそれぞれは異なる核酸配列を持ち、
前記少なくとも3つの付着位置の各位置の核酸配列が、前記標的結合ドメインが結合する前記標的核酸の中の前記少なくとも6個のヌクレオチドのうちの対応する2個のヌクレオチドの位置と属性を決めている、シークエンシング用プローブ。
【請求項３】
標的結合ドメインとバーコードドメインを含むシークエンシング用プローブであって；
前記標的結合ドメインは少なくとも10個のヌクレオチドを含んでいて標的核酸に結合することができ、前記標的結合ドメインの中の少なくとも6個のヌクレオチドは、前記標的核酸分子の中の対応するヌクレオチドを同定することができ、前記標的結合ドメインの中の少なくとも4個のヌクレオチドは、前記標的核酸分子の中の対応するヌクレオチドを同定することがなく；
前記バーコードドメインは合成骨格を含んでいて、前記バーコードドメインは少なくとも3つの付着位置を含み、それぞれの付着位置は、相補的核酸分子が結合することのできる少なくとも1つの核酸配列を含む少なくとも1つの付着領域を含み、前記少なくとも3つの付着位置の核酸配列が、前記標的結合ドメインが結合する前記標的核酸の中の前記少なくとも6個のヌクレオチドの位置と属性を決めており、前記少なくとも3つの付着位置のそれぞれは異なる核酸配列を有する、シークエンシング用プローブ。
【請求項４】
標的結合ドメインとバーコードドメインを含むシークエンシング用プローブであって；
前記標的結合ドメインは少なくとも10個のヌクレオチドを含んでいて標的核酸に結合することができ、前記標的結合ドメインの中の少なくとも6個のヌクレオチドは、前記標的核酸分子の中の対応するヌクレオチドを同定することができ、前記標的結合ドメインの中の少なくとも4個のヌクレオチドは、前記標的核酸分子の中の対応するヌクレオチドを同定することがなく；
前記バーコードドメインは合成骨格を含んでいて、前記バーコードドメインは少なくとも3つの付着位置を含み、それぞれの付着位置は、相補的核酸分子が結合することのできる少なくとも1つの核酸配列を含む少なくとも1つの付着領域を含み、
前記少なくとも3つの付着位置のそれぞれは、前記標的結合ドメインの中の前記少なくとも6個のヌクレオチドのうちの2個のヌクレオチドに対応するとともに、前記少なくとも3つの付着位置のそれぞれは異なる核酸配列を持ち、
前記少なくとも3つの付着位置の各位置の核酸配列が、前記標的結合ドメインが結合する前記標的核酸の中の前記少なくとも6個のヌクレオチドのうちの対応する2個のヌクレオチドの位置と属性を決めている、シークエンシング用プローブ。
【請求項５】
a）標的結合ドメインとバーコードドメインを含む組成物
（ここで、前記標的結合ドメインは少なくとも8個のヌクレオチドを含んでいて標的核酸に結合することができ、前記標的結合ドメインの中の少なくとも6個のヌクレオチドは、前記標的核酸分子の中の対応するヌクレオチドを同定することができ、前記標的結合ドメインの中の少なくとも2個のヌクレオチドは、前記標的核酸分子の中の対応するヌクレオチドを同定することがなく；
前記標的結合ドメインの中の前記少なくとも6個のヌクレオチドのうちの少なくとも2個のヌクレオチドは、修飾されたヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体であり；
前記バーコードドメインは合成骨格を含んでいて、前記バーコードドメインは少なくとも3つの付着位置を含み、それぞれの付着位置は、相補的核酸分子が結合することのできる少なくとも1つの核酸配列を含む少なくとも1つの付着領域を含み、前記少なくとも3つの付着位置の核酸配列が、前記標的結合ドメインが結合する前記標的核酸の中の前記少なくとも6個のヌクレオチドの位置と属性を決めており、前記少なくとも3つの付着位置のそれぞれは異なる核酸配列を有する）と；
前記少なくとも3つの付着位置の第1の付着位置にハイブリダイズする第1の相補的一次核酸分子
（ここで、前記第1の相補的一次核酸分子は、少なくとも2つのドメインとリンカー修飾を含んでおり、
そのうちの第1のドメインは、前記バーコードドメインの第1の付着位置にハイブリダイズし、第2のドメインは、少なくとも1つの第2の相補的二次核酸分子にハイブリダイズすることができ、
前記リンカー修飾は、
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2024156813000016.jpg
110
170
のいずれかであり、このリンカー修飾は第1のドメインと第2のドメインの間に位置する）を含む複合体。
【請求項６】
a）標的結合ドメインとバーコードドメインを含む組成物
（ここで、前記標的結合ドメインは少なくとも8個のヌクレオチドを含んでいて標的核酸に結合することができ、前記標的結合ドメインの中の少なくとも6個のヌクレオチドは、前記標的核酸分子の中の対応するヌクレオチドを同定することができ、前記標的結合ドメインの中の少なくとも2個のヌクレオチドは、前記標的核酸分子の中の対応するヌクレオチドを同定することがなく；
前記標的結合ドメインの中の前記少なくとも6個のヌクレオチドのうちの少なくとも2個のヌクレオチドは、修飾されたヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体であり；
前記バーコードドメインは合成骨格を含んでいて、前記バーコードドメインは少なくとも3つの付着位置を含み、それぞれの付着位置は、相補的核酸分子が結合することのできる少なくとも1つの核酸配列を含む少なくとも1つの付着領域を含み、前記少なくとも3つの付着位置の核酸配列が、前記標的結合ドメインが結合する前記標的核酸の中の前記少なくとも6個のヌクレオチドの位置と属性を決めており、
前記少なくとも3つの付着位置のそれぞれは、前記標的結合ドメインの中の前記少なくとも6個のヌクレオチドのうちの2個のヌクレオチドに対応するとともに、前記少なくとも3つの付着位置のそれぞれは異なる核酸配列を持ち、
前記少なくとも3つの付着位置の各位置の核酸配列が、前記標的結合ドメインが結合する前記標的核酸の中の前記少なくとも6個のヌクレオチドのうちの対応する2個のヌクレオチドの位置と属性を決めている）と；
前記少なくとも3つの付着位置の第1の付着位置にハイブリダイズする第1の相補的一次核酸分子
（ここで、前記第1の相補的一次核酸分子は、少なくとも2つのドメインとリンカー修飾を含んでおり、
そのうちの第1のドメインは、前記バーコードドメインの第1の付着位置にハイブリダイズし、第2のドメインは、少なくとも1つの第2の相補的二次核酸分子にハイブリダイズすることができ、
前記リンカー修飾は、
JPEG
2024156813000017.jpg
112
170
のいずれかであり、このリンカー修飾は第1のドメインと第2のドメインの間に位置する）を含む複合体。
【請求項７】
前記合成骨格が、多糖、ポリヌクレオチド、ペプチド、ペプチド核酸、ポリペプチドのいずれかを含む、請求項1～4のいずれか1項に記載のシークエンシング用プローブ。
【請求項８】
前記合成骨格が一本鎖DNAを含む、請求項1～4のいずれか1項に記載のシークエンシング用プローブ。
【請求項９】
一本鎖DNA合成骨格と、前記標的結合ドメインと前記バーコードドメインの間にある二本鎖DNAスペーサとを含む、請求項1～4のいずれか1項に記載のシークエンシング用プローブ。
【請求項１０】
前記二本鎖DNAスペーサが、長さ約1個～約100個のヌクレオチドである、請求項9に記載のシークエンシング用プローブ。
（【請求項１１】以降は省略されています）
発明の詳細な説明【技術分野】
【０００１】
関連する出願の相互参照
本出願は、2016年11月21日に出願されたアメリカ合衆国仮出願第62/424,887号と、2017年2月10日に出願されたアメリカ合衆国仮出願第62/457,237号と、2017年7月24日に出願されたアメリカ合衆国仮出願第62/536,147号の優先権と恩恵を主張する。上記特許出願のそれぞれの内容は、前記全体が参照によって本明細書に組み込まれている。
続きを表示（約 4,800 文字）【０００２】
配列リスト
本出願は、EFS-Webを通じてASCII形式で提出された配列リストを含有しており、前記全体が参照によって本明細書に組み込まれている。このASCIIのコピーは2017年11月20日に作成されてNATE033-001WO_SeqList_ST25.txtと名づけられており、サイズは19,351バイトである。
【背景技術】
【０００３】
現在、核酸のシークエンシング、すなわち核酸分子の中のヌクレオチドの正確な順番を求めるプロセスにはさまざまな方法がある。現在の方法は、核酸を酵素によって増幅すること（例えばPCR）および／またはクローニングによって増幅することを必要とする。光検出手段によって検出できる信号を発生させるには、酵素によるさらなるポリマー化が必要とされる。したがって本分野では、迅速で増幅と酵素が不要な核酸シークエンシングの方法が必要とされている。本開示は前記ような必要性に応える。
【発明の概要】
【０００４】
本開示により、読み出し長が長く、エラー率が小さく、迅速で、酵素と増幅とライブラリが不要な核酸シークエンシングを提供するシークエンシング用プローブと、方法と、キットと、装置が提供される。本明細書に記載したシークエンシング用プローブはバーコードドメインを含んでいて、前記バーコードドメインの中の各位置は、標的結合ドメインの中の少なくとも2個のヌクレオチドに対応している。さらに、この方法、キット、装置は、サンプルから結果を迅速に取得する能力を有する。これらの特徴は、臨床状況におけるシークエンシングで特に有用である。本開示は、アメリカ合衆国特許出願公開第2016/0194701号に開示されている開示内容（前記内容全体が参照によって本明細書に組み込まれている）の改良である。
【０００５】
本開示により、a）標的結合ドメインとバーコードドメインを含む組成物（ここで、標的結合ドメインは少なくとも8個のヌクレオチドを含んでいて標的核酸に結合することができ、前記標的結合ドメインの中の少なくとも6個のヌクレオチドは、前記標的核酸分子の中の対応するヌクレオチドを同定することができ、前記標的結合ドメインの中の少なくとも2個のヌクレオチドは、前記標的核酸分子の中の対応するヌクレオチドを同定することがなく；前記標的結合ドメインの中の前記少なくとも6個のヌクレオチドのうちの少なくとも2個のヌクレオチドは、修飾されたヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体であり；バーコードドメインは合成骨格を含んでいて、前記バーコードドメインは少なくとも3つの付着位置を含み、それぞれの付着位置は、相補的核酸分子が結合することのできる少なくとも1つの核酸配列を含む少なくとも1つの付着領域を含み、前記少なくとも3つの付着位置の核酸配列が、前記標的結合ドメインが結合する前記標的核酸の中の前記少なくとも6個のヌクレオチドの位置と属性（identity）を決めており、前記少なくとも3つの付着位置のそれぞれは異なる核酸配列を有する）と；前記少なくとも3つの付着位置の第1の付着位置にハイブリダイズする第1の相補的一次核酸分子（ここで、前記第1の相補的一次核酸分子は、少なくとも2つのドメインとリンカー修飾を含んでおり、そのうちの第1のドメインは、前記バーコードドメインの第1の付着位置にハイブリダイズし、第2のドメインは、少なくとも1つの第2の相補的二次核酸分子にハイブリダイズすることができ、前記リンカー修飾は、
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2024156813000001.jpg
116
170
のいずれかであり、このリンカー修飾は第1のドメインと第2のドメインの間に位置する）を含む複合体が提供される。
【０００６】
本開示により、a）標的結合ドメインとバーコードドメインを含む組成物（ここで、標的結合ドメインは少なくとも8個のヌクレオチドを含んでいて標的核酸に結合することができ、前記標的結合ドメインの中の少なくとも6個のヌクレオチドは、前記標的核酸分子の中の対応するヌクレオチドを同定することができ、前記標的結合ドメインの中の少なくとも2個のヌクレオチドは、前記標的核酸分子の中の対応するヌクレオチドを同定することがなく；前記標的結合ドメインの中の前記少なくとも6個のヌクレオチドのうちの少なくとも2個のヌクレオチドは、修飾されたヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体であり；バーコードドメインは合成骨格を含んでいて、前記バーコードドメインは少なくとも3つの付着位置を含み、それぞれの付着位置は、相補的核酸分子が結合することのできる少なくとも1つの核酸配列を含む少なくとも1つの付着領域を含み、前記少なくとも3つの付着位置の核酸配列が、前記標的結合ドメインが結合する前記標的核酸の中の前記少なくとも6個のヌクレオチドの位置と属性を決めており、前記少なくとも3つの付着位置のそれぞれは、前記標的結合ドメインの中の前記少なくとも6個のヌクレオチドのうちの2個のヌクレオチドに対応するとともに、前記少なくとも3つの付着位置のそれぞれは異なる核酸配列を持ち、前記少なくとも3つの付着位置の各位置の核酸配列が、前記標的結合ドメインが結合する前記標的核酸の中の前記少なくとも6個のヌクレオチドのうちの対応する2個のヌクレオチドの位置と属性を決めている）と；前記少なくとも3つの付着位置の第1の付着位置にハイブリダイズする第1の相補的一次核酸分子（ここで、前記第1の相補的一次核酸分子は、少なくとも2つのドメインとリンカー修飾を含んでおり、そのうちの第1のドメインは、前記バーコードドメインの第1の付着位置にハイブリダイズし、第2のドメインは、少なくとも1つの第2の相補的二次核酸分子にハイブリダイズすることができ、前記リンカー修飾は、
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115
170
のいずれかであり、このリンカー修飾は第1のドメインと第2のドメインの間に位置する）を含む複合体が提供される。
【０００７】
本開示により、標的結合ドメインとバーコードドメインを含むシークエンシング用プローブとして；標的結合ドメインは少なくとも8個のヌクレオチドを含んでいて標的核酸に結合することができ、前記標的結合ドメインの中の少なくとも6個のヌクレオチドは、前記標的核酸分子の中の対応するヌクレオチドを同定することができ、前記標的結合ドメインの中の少なくとも2個のヌクレオチドは、前記標的核酸分子の中の対応するヌクレオチドを同定することがなく；前記標的結合ドメインの中の前記少なくとも6個のヌクレオチドのうちの少なくとも2個のヌクレオチドは、修飾されたヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体であり；バーコードドメインは合成骨格を含んでいて、前記バーコードドメインは少なくとも3つの付着位置を含み、それぞれの付着位置は、相補的核酸分子が結合することのできる少なくとも1つの核酸配列を含む少なくとも1つの付着領域を含み、前記少なくとも3つの付着位置の核酸配列が、前記標的結合ドメインが結合する前記標的核酸の中の前記少なくとも6個のヌクレオチドの位置と属性を決めており、前記少なくとも3つの付着位置のそれぞれは異なる核酸配列を有するシークエンシング用プローブが提供される。
【０００８】
本開示により、標的結合ドメインとバーコードドメインを含むシークエンシング用プローブとして；標的結合ドメインは少なくとも8個のヌクレオチドを含んでいて標的核酸に結合することができ、前記標的結合ドメインの中の少なくとも6個のヌクレオチドは、前記標的核酸分子の中の対応するヌクレオチドを同定することができ、前記標的結合ドメインの中の少なくとも2個のヌクレオチドは、前記標的核酸分子の中の対応するヌクレオチドを同定することがなく；前記標的結合ドメインの中の前記少なくとも6個のヌクレオチドのうちの少なくとも2個のヌクレオチドは、修飾されたヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体であり；バーコードドメインは合成骨格を含んでいて、前記バーコードドメインは少なくとも3つの付着位置を含み、それぞれの付着位置は、相補的核酸分子が結合することのできる少なくとも1つの核酸配列を含む少なくとも1つの付着領域を含み、前記少なくとも3つの付着位置のそれぞれは、前記標的結合ドメインの中の前記少なくとも6個のヌクレオチドのうちの2個のヌクレオチドに対応するとともに、前記少なくとも3つの付着位置のそれぞれは異なる核酸配列を持ち、前記少なくとも3つの付着位置の各位置の核酸配列が、前記標的結合ドメインが結合する前記標的核酸の中の前記少なくとも6個のヌクレオチドのうちの対応する2個のヌクレオチドの位置と属性を決めているシークエンシング用プローブが提供される。
【０００９】
本開示により、標的結合ドメインとバーコードドメインを含むシークエンシング用プローブとして；標的結合ドメインは少なくとも10個のヌクレオチドを含んでいて標的核酸に結合することができ、前記標的結合ドメインの中の少なくとも6個のヌクレオチドは、前記標的核酸分子の中の対応するヌクレオチドを同定することができ、前記標的結合ドメインの中の少なくとも4個のヌクレオチドは、前記標的核酸分子の中の対応するヌクレオチドを同定することがなく；バーコードドメインは合成骨格を含んでいて、前記バーコードドメインは少なくとも3つの付着位置を含み、それぞれの付着位置は、相補的核酸分子が結合することのできる少なくとも1つの核酸配列を含む少なくとも1つの付着領域を含み、前記少なくとも3つの付着位置の核酸配列が、前記標的結合ドメインが結合する前記標的核酸の中の前記少なくとも6個のヌクレオチドの位置と属性を決めており、前記少なくとも3つの付着位置のそれぞれは異なる核酸配列を有するシークエンシング用プローブが提供される。
【００１０】
本開示により、標的結合ドメインとバーコードドメインを含むシークエンシング用プローブとして；標的結合ドメインは少なくとも10個のヌクレオチドを含んでいて標的核酸に結合することができ、前記標的結合ドメインの中の少なくとも6個のヌクレオチドは、前記標的核酸分子の中の対応するヌクレオチドを同定することができ、前記標的結合ドメインの中の少なくとも4個のヌクレオチドは、前記標的核酸分子の中の対応するヌクレオチドを同定することがなく；バーコードドメインは合成骨格を含んでいて、前記バーコードドメインは少なくとも3つの付着位置を含み、それぞれの付着位置は、相補的核酸分子が結合することのできる少なくとも1つの核酸配列を含む少なくとも1つの付着領域を含み、前記少なくとも3つの付着位置のそれぞれは、前記標的結合ドメインの中の前記少なくとも6個のヌクレオチドのうちの2個のヌクレオチドに対応するとともに、前記少なくとも3つの付着位置のそれぞれは異なる核酸配列を持ち、前記少なくとも3つの付着位置の各位置の核酸配列が、前記標的結合ドメインが結合する前記標的核酸の中の前記少なくとも6個のヌクレオチドのうちの対応する2個のヌクレオチドの位置と属性を決めているシークエンシング用プローブが提供される。
（【００１１】以降は省略されています）

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