特許ウォッチ

公開番号2024156665
公報種別公開特許公報(A)
公開日2024-11-06
出願番号2024106599,2021535281
出願日2024-07-02,2019-12-18
発明の名称タンパク質をコードするRNA
出願人ヴェルサメブアーゲー
代理人園田・小林弁理士法人
主分類C12N 15/62 20060101AFI20241029BHJP(生化学;ビール;酒精;ぶどう酒;酢;微生物学;酵素学;突然変異または遺伝子工学)
要約【課題】タンパク質およびシグナルペプチドをコードする核酸配列を含むmRNA、ならびにタンパク質およびシグナルペプチドをコードする核酸を含む転写単位、発現ベクターまたは遺伝子治療用ベクターを提供する。
【解決手段】5’から3’方向に以下の順番で、i)シグナルペプチドおよびii)タンパク質をコードする核酸配列を含むmRNAであって、シグナルペプチドのアミノ酸配列のN末端のアミノ酸1～9は、2.2に等しいかまたはそれを超える平均疎水性スコアを有し、疎水性スコアは、カイト-デューリトルのスケールにより計算され、かつ、シグナルペプチドは、前記タンパク質にとって異種のシグナルペプチドであり、シグナルペプチドは、長さ16から40アミノ酸のアミノ酸配列からなり、ただし前記タンパク質はオキシドレダクターゼではない、mRNAが提供される。
【選択図】なし
特許請求の範囲【請求項１】
タンパク質およびシグナルペプチドをコードする核酸配列を含むｍＲＮＡであって、
シグナルペプチドのアミノ酸配列のＮ末端のアミノ酸１～９は、２を超える平均疎水性スコアを有し、シグナルペプチドは、
ｉ）前記タンパク質にとって異種のシグナルペプチドであって、前記タンパク質にとって異種のシグナルペプチドは、必要に応じて、少なくとも１つのアミノ酸の挿入、欠失および／または置換によって修飾されており、ただし前記タンパク質はオキシドレダクターゼではない、前記タンパク質にとって異種のシグナルペプチド；
ｉｉ）前記タンパク質に相同なシグナルペプチドであって、少なくとも１つのアミノ酸の挿入、欠失および／または置換によって修飾されている、前記タンパク質に相同なシグナルペプチド；および
ｉｉｉ）自然状態でシグナルペプチドの機能を有さない天然に存在するアミノ酸配列であって、必要に応じて少なくとも１つのアミノ酸の挿入、欠失および／または置換によって修飾されている、天然に存在するアミノ酸配列
からなる群から選択される、ｍＲＮＡ。
続きを表示（約 1,000 文字）【請求項２】
シグナルペプチドのアミノ酸配列のＮ末端のアミノ酸１～９が、６．１またはそれ未満の平均極性を有する、請求項１に記載のｍＲＮＡ。
【請求項３】
シグナルペプチドのアミノ酸配列のＣ末端の最後の９つのアミノ酸の平均疎水性スコアが、シグナルペプチドのアミノ酸配列のＮ末端のアミノ酸１～９の平均疎水性スコアより少なくとも１．０単位低い、請求項１または２に記載のｍＲＮＡ。
【請求項４】
シグナルペプチドのアミノ酸配列のＮ末端のアミノ酸１～９、アミノ酸２～１０、アミノ酸３～１１、アミノ酸４～１２およびアミノ酸５～１３が、それぞれ１．５を超える平均疎水性スコアを有する、請求項１から３のいずれか一項に記載のｍＲＮＡ。
【請求項５】
シグナルペプチドのアミノ酸配列のＮ末端のアミノ酸８～１６の平均疎水性スコアが、シグナルペプチドのアミノ酸配列のＮ末端のアミノ酸３～１１の平均疎水性スコアに等しいかまたはそれより低い、請求項１から４のいずれか一項に記載のｍＲＮＡ。
【請求項６】
シグナルペプチドが、長さ１８～４０アミノ酸のアミノ酸配列を含み、シグナルペプチドのアミノ酸配列のＮ末端のアミノ酸１０～１８の平均疎水性スコアは、シグナルペプチドのアミノ酸配列のＮ末端のアミノ酸３～１１の平均疎水性スコアより少なくとも０．５単位低い、請求項１から４のいずれか一項に記載のｍＲＮＡ。
【請求項７】
シグナルペプチドのアミノ酸配列のＣ末端の最後の９つのアミノ酸の平均疎水性スコアが、シグナルペプチドのアミノ酸配列のＮ末端のアミノ酸３～１１の平均疎水性スコアより少なくとも１．５単位低い、請求項１から６のいずれか一項に記載のｍＲＮＡ。
【請求項８】
シグナルペプチドのアミノ酸配列の任意の９つの連続するアミノ酸の平均疎水性スコアが、４．１を超えない、請求項１から７のいずれか一項に記載のｍＲＮＡ。
【請求項９】
シグナルペプチドのアミノ酸配列のＣ末端の最後の９つのアミノ酸が、負の疎水性スコアを有する少なくとも１つのアミノ酸を含む、請求項１から８のいずれか一項に記載のｍＲＮＡ。
【請求項１０】
負の疎水性スコアを有する少なくとも１つのアミノ酸が、Ｇ、Ｑ、Ｎ、Ｔ、Ｓ、Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ｄ、Ｅ、Ｐ、ＹおよびＷからなる群から選択される、請求項９に記載のｍＲＮＡ。
（【請求項１１】以降は省略されています）
発明の詳細な説明【技術分野】
【０００１】
本発明は、タンパク質およびシグナルペプチドをコードする核酸配列を含むｍＲＮＡであって、シグナルペプチドのアミノ酸配列のＮ末端のアミノ酸１～９は、２を超える平均疎水性スコアを有し、シグナルペプチドは、
ｉ）前記タンパク質にとって異種のシグナルペプチドであって、前記タンパク質にとって異種のシグナルペプチドは、必要に応じて、少なくとも１つのアミノ酸の挿入、欠失および／または置換によって修飾されており、ただし前記タンパク質はオキシドレダクターゼではない、前記タンパク質にとって異種のシグナルペプチド；
ｉｉ）前記タンパク質に相同なシグナルペプチドであって、少なくとも１つのアミノ酸の挿入、欠失および／または置換によって修飾されている、前記タンパク質に相同なシグナルペプチド；および
ｉｉｉ）自然状態でシグナルペプチドの機能を有さない天然に存在するアミノ酸配列であって、必要に応じて少なくとも１つのアミノ酸の挿入、欠失および／または置換によって修飾されている、天然に存在するアミノ酸配列
からなる群から選択される、ｍＲＮＡに関する。
続きを表示（約 15,000 文字）【０００２】
本発明はさらに、ｉ）タンパク質；およびｉｉ）前記タンパク質にとって異種のシグナルペプチドをコードする核酸配列を含むｍＲＮＡであって、前記タンパク質にとって異種のシグナルペプチドは、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）のシグナルペプチドであり、前記タンパク質は、オキシドレダクターゼではない、ｍＲＮＡに関する。また本発明は、タンパク質およびシグナルペプチドをコードする核酸配列を含む転写単位または発現ベクターであって、シグナルペプチドのアミノ酸配列のＮ末端のアミノ酸１～９は、２を超える平均疎水性スコアを有し、シグナルペプチドは、
ｉ）前記タンパク質にとって異種のシグナルペプチドであって、前記タンパク質にとって異種のシグナルペプチドは、必要に応じて、少なくとも１つのアミノ酸の挿入、欠失および／または置換によって修飾されており、ただし前記タンパク質はオキシドレダクターゼではない、前記タンパク質にとって異種のシグナルペプチド；
ｉｉ）前記タンパク質に相同なシグナルペプチドであって、少なくとも１つのアミノ酸の挿入、欠失および／または置換によって修飾されている、前記タンパク質に相同なシグナルペプチド；および
ｉｉｉ）自然状態でシグナルペプチドの機能を有さない天然に存在するアミノ酸配列であって、必要に応じて少なくとも１つのアミノ酸の挿入、欠失および／または置換によって修飾されている、天然に存在するアミノ酸配列
からなる群から選択される、転写単位または発現ベクターにも関する。また本発明は、前記タンパク質にとって異種のタンパク質およびシグナルペプチドをコードする核酸配列を含む転写単位または発現ベクターであって、前記タンパク質にとって異種のシグナルペプチドは、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）のシグナルペプチドである、転写単位または発現ベクターにも関する。また本発明は、ｍＲＮＡ、および／または転写単位もしくは発現ベクターを含む、治療用組成物およびキットにも関する。また本発明は、医薬として使用するための、ｍＲＮＡ、転写単位または発現ベクター、治療用組成物および／またはキットにも関し、特に、医薬として使用するための、ｉ）ＩＧＦ１；およびｉｉ）脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）のシグナルペプチドをコードする核酸配列を含むｍＲＮＡにも関する。また本発明は、骨格筋損傷を処置する方法での使用のためのｍＲＮＡおよびその治療用組成物にも関する。
【背景技術】
【０００３】
これまでに、コードされたタンパク質の発現および分泌の収量を増加させるために、様々な試みが、特にインビトロおよび／またはインビボの両方での改善された発現系の使用によって、なされてきた。一般的に先行技術に記載された発現および分泌を増加させるための方法は、慣習的に、特異的なプロモーターおよび対応する調節エレメントを含有する発現ベクターまたはカセットの使用に基づく。これらの発現ベクターまたはカセットは、典型的には特定の細胞系に限定されるため、これらの発現系は、異なる細胞系で使用する場合、適合させる必要がある。次いでこのような適合させた発現ベクターまたはカセットは通常、細胞にトランスフェクトされ、典型的には特定の細胞株に応じて処置される。それ故に、主として、特定の細胞型に特異的なプロモーターおよび調節エレメントから独立した細胞に固有の系によって、標的細胞においてコードされたタンパク質を発現することができる、ｍＲＮＡのような核酸分子が選ばれる。この状況において、ｍＲＮＡを安定化するエレメントと、ｍＲＮＡの翻訳効率を増加させるエレメントを区別することができる。例えば、ＷＯ０２／０９８４４３は、一般的な形態で安定化され、そのコード化領域において翻訳に最適化されたｍＲＮＡを記載している。ＷＯ０２／０９８４４３はさらに、配列修飾を決定するための方法を開示している。ＷＯ０２／０９８４４３は、加えて、配列のグアニン／シトシン（Ｇ／Ｃ）含有量を増加させるためにｍＲＮＡ配列中のアデニンおよびウラシルヌクレオチドを置換する可能性を記載している。この状況において、ＷＯ０２／０９８４４３は、概して、このような修飾に関する塩基配列としての配列に言及しており、修飾されたｍＲＮＡは、処置しようとする患者で翻訳される少なくとも１つの生物学的に活性なペプチドまたはポリペプチドを、例えば、間違いがまったくないか、または不十分に、または多少の間違いを含んでのいずれかでコードする。コードされたタンパク質の発現を増加させるためのさらなるアプローチにおいて、ＷＯ２００７／０３６３６６号出願は、長いポリ（Ａ）配列（特に１２０ｂｐより長い）ならびにｍＲＮＡ安定性および翻訳活性へのベータグロビン遺伝子の少なくとも２つの３’非翻訳領域の組合せのプラスの作用を記載している。当業界における全ての進歩にもかかわらず、無細胞の系、細胞または生物体（組換え発現）におけるコードされたタンパク質の効率的な発現、特に効率的な分泌は、それでもなお挑戦しがいのある課題である。
【発明の概要】
【０００４】
本発明は、タンパク質およびシグナルペプチドをコードする核酸配列を含むｍＲＮＡであって、シグナルペプチドのアミノ酸配列のＮ末端のアミノ酸１～９は、２を超える平均疎水性スコアを有し、シグナルペプチドは、
ｉ）前記タンパク質にとって異種のシグナルペプチドであって、前記タンパク質にとって異種のシグナルペプチドは、必要に応じて、少なくとも１つのアミノ酸の挿入、欠失および／または置換によって修飾されており、ただし前記タンパク質はオキシドレダクターゼではない、前記タンパク質にとって異種のシグナルペプチド；
ｉｉ）前記タンパク質に相同なシグナルペプチドであって、少なくとも１つのアミノ酸の挿入、欠失および／または置換によって修飾されている、前記タンパク質に相同なシグナルペプチド；および
ｉｉｉ）自然状態でシグナルペプチドの機能を有さない天然に存在するアミノ酸配列であって、必要に応じて少なくとも１つのアミノ酸の挿入、欠失および／または置換によって修飾されている、天然に存在するアミノ酸配列
からなる群から選択される、ｍＲＮＡを提供する。
【０００５】
本発明はさらに、
ｉ）タンパク質；および
ｉｉ）前記タンパク質にとって異種のシグナルペプチド
をコードする核酸配列を含むｍＲＮＡであって、
前記タンパク質にとって異種のシグナルペプチドは、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）のシグナルペプチドであり、前記タンパク質は、オキシドレダクターゼではない、ｍＲＮＡを提供し、特に、本発明は、
ｉ）タンパク質；および
ｉｉ）前記タンパク質にとって異種のシグナルペプチド
をコードする核酸配列を含むｍＲＮＡであって、
前記タンパク質にとって異種のシグナルペプチドは、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）のシグナルペプチドであり、前記タンパク質は、カルボキシペプチダーゼ；サイトカイン；細胞外のリガンドおよび輸送体；細胞外マトリックスタンパク質；グルコシダーゼ；グリコシルトランスフェラーゼ；増殖因子；増殖因子結合タンパク質；ヘパリン結合タンパク質；ホルモン；ヒドロラーゼ；免疫グロブリン；イソメラーゼ；キナーゼ；リアーゼ；金属酵素阻害剤；メタロプロテアーゼ；乳タンパク質；神経刺激性タンパク質；プロテアーゼ；プロテアーゼ阻害剤；タンパク質ホスファターゼ；エステラーゼ；トランスフェラーゼ；および血管作動性タンパク質からなる群から選択される、ｍＲＮＡを提供する。
【０００６】
本発明はさらに、タンパク質およびシグナルペプチドをコードする核酸配列を含む転写単位または発現ベクターであって、シグナルペプチドのアミノ酸配列のＮ末端のアミノ酸１～９は、２を超える平均疎水性スコアを有し、シグナルペプチドは、
ｉ）前記タンパク質にとって異種のシグナルペプチドであって、前記タンパク質にとって異種のシグナルペプチドは、必要に応じて、少なくとも１つのアミノ酸の挿入、欠失および／または置換によって修飾されており、ただし前記タンパク質はオキシドレダクターゼではない、前記タンパク質にとって異種のシグナルペプチド；
ｉｉ）前記タンパク質に相同なシグナルペプチドであって、少なくとも１つのアミノ酸の挿入、欠失および／または置換によって修飾されている、前記タンパク質に相同なシグナルペプチド；および
ｉｉｉ）自然状態でシグナルペプチドの機能を有さない天然に存在するアミノ酸配列であって、必要に応じて少なくとも１つのアミノ酸の挿入、欠失および／または置換によって修飾されている、天然に存在するアミノ酸配列
からなる群から選択される、転写単位または発現ベクターを提供する。
【０００７】
本発明はさらに、前記タンパク質にとって異種のシグナルペプチドは、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）のシグナルペプチドであり、前記タンパク質は、オキシドレダクターゼではない、前記タンパク質にとって異種のタンパク質およびシグナルペプチドをコードする核酸配列を含む転写単位または発現ベクターを提供する。本発明はさらに、前記タンパク質にとって異種のシグナルペプチドは、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）のシグナルペプチドであり、タンパク質は、カルボキシペプチダーゼ；サイトカイン；細胞外のリガンドおよび輸送体；細胞外マトリックスタンパク質；グルコシダーゼ；グリコシルトランスフェラーゼ；増殖因子；増殖因子結合タンパク質；ヘパリン結合タンパク質；ホルモン；ヒドロラーゼ；免疫グロブリン；イソメラーゼ；キナーゼ；リアーゼ；金属酵素阻害剤；メタロプロテアーゼ；乳タンパク質；神経刺激性タンパク質；プロテアーゼ；プロテアーゼ阻害剤；タンパク質ホスファターゼ；エステラーゼ；トランスフェラーゼ；および血管作動性タンパク質からなる群から選択される、前記タンパク質にとって異種のタンパク質およびシグナルペプチドをコードする核酸配列を含む転写単位または発現ベクターを提供する。本発明はさらに、上述のｍＲＮＡおよび／または転写単位もしくは発現ベクターを含む治療用組成物を提供する。本発明はさらに、上述のｍＲＮＡ、転写単位または発現ベクターおよび／または治療用組成物、ならびに使用説明書、必要に応じてベクターマップ、必要に応じて宿主細胞、必要に応じて宿主細胞の培養のための培地、および／もしくは必要に応じてトランスフェクトされた宿主細胞を選択および培養するための選択培地を含むキットを提供する。本発明はさらに、医薬として使用するための、上述のｍＲＮＡ、転写単位または発現ベクター、治療用組成物またはキットを提供する。本発明はさらに、医薬として使用するための、ｉ）ＩＧＦ１；およびｉｉ）脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）のシグナルペプチドをコードする核酸配列を含むｍＲＮＡを提供する。本発明はさらに、骨格筋損傷を処置する方法での使用のための、ｍＲＮＡまたはｍＲＮＡを含有する治療用組成物を提供する。
【０００８】
本発明者らは、驚くべきことに、タンパク質およびシグナルペプチドをコードする核酸配列を含むｍＲＮＡであって、シグナルペプチドのアミノ酸配列のＮ末端のアミノ酸１～９は、２を超える平均疎水性スコアを有し、シグナルペプチドは、
ｉ）前記タンパク質にとって異種のシグナルペプチドであって、前記タンパク質にとって異種のシグナルペプチドは、必要に応じて、少なくとも１つのアミノ酸の挿入、欠失および／または置換によって修飾されており、ただし前記タンパク質はオキシドレダクターゼではない、前記タンパク質にとって異種のシグナルペプチド；
ｉｉ）前記タンパク質に相同なシグナルペプチドであって、少なくとも１つのアミノ酸の挿入、欠失および／または置換によって修飾されている、前記タンパク質に相同なシグナルペプチド；および
ｉｉｉ）自然状態でシグナルペプチドの機能を有さない天然に存在するアミノ酸配列であって、必要に応じて少なくとも１つのアミノ酸の挿入、欠失および／または置換によって修飾されている、天然に存在するアミノ酸配列
からなる群から選択される、ｍＲＮＡは、タンパク質およびその天然の相同なシグナルペプチドをコードするｍＲＮＡでトランスフェクトされた細胞によるタンパク質の分泌と比較して、このｍＲＮＡでトランスフェクトされた細胞によるタンパク質のより効率的な分泌を提供することを見出した。特に、本発明者らは、驚くべきことに、ｉ）タンパク質；およびｉｉ）前記タンパク質にとって異種のＢＤＮＦシグナルペプチドをコードする核酸配列を含むｍＲＮＡは、タンパク質の天然の相同なシグナルペプチドと比べて、このｍＲＮＡでトランスフェクトされた細胞によるタンパク質のより効率的な分泌を提供することを見出した。分泌タンパク質の量は、同じタンパク質およびタンパク質の天然の相同なシグナルペプチドを含むｍＲＮＡと比較して、最大で６倍多い。この予想外の発見は、所望のタンパク質をコードするｍＲＮＡを効果的に送達し、細胞中で発現させ、タンパク質の天然の相同なシグナルペプチドを有するものより多くの量の分泌タンパク質を得るのに非常に有用である。本発明によって提供される同じ量のｍＲＮＡを用いて得られた、より多くの量の分泌タンパク質は、治療用量を、組織に局所適用するのに必要な用量より少なくし、それによって起こり得るｍＲＮＡ関連の副作用に対するその安全性の枠を増加させるために極めて有用である。さらにこれは、本出願を、制御放出のための製剤やデバイスのコーティングにより適したものにしている。さらにこれは、ｍＲＮＡ関連の免疫原性のリスクを低減し、本出願を、限られた体積しか注射できない組織に対して、またはこれまで処理しにくい組織により適したものにしている。本発明者らはまた、ｍＲＮＡ、特にヒトＩＧＦ－１をコードするｍＲＮＡを骨格筋に効果的に送達し、発現させることを可能にし、それによって骨格筋における所望のポリペプチドの発現を可能にし、意味のある機能的な利益が筋肉に提供されることも見出した。ｍＲＮＡは、好ましくは液体組成物で、好ましくは裸の形態で存在する。この液体組成物は、例えば注射によって骨格筋に直接送達することができ、ｍＲＮＡのための遺伝子移入ベクターまたは担体、またはエレクトロトランスファーまたは超音波のような組織への移入を強化するための方法をまったく必要としない。さらに、損傷を受けた骨格筋へのｍＲＮＡの注射は、回復プロセスを促進し、骨格筋の機能の増加をもたらすことが示された。驚くべきことに、ＩＧＦ－１をコードするｍＲＮＡで処置した動物は、１６日間の間に（ｂｙ１６ｄａｙｓ）健康な範囲の機能的なレベルに到達した。対照的に、ビヒクルで処置した対照動物は、２８日目でさえも十分な機能的な回復を達成しなかった。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
Ｃｐｄ．１のＤＮＡおよびＲＮＡ配列を示す図である。（Ａ）は、そのプレドメイン、プロドメインおよびコードドメインを含有するヒトコドン最適化ＩＧＦ１のＤＮＡ配列（配列番号１）を示す。プレドメイン（シグナル伝達ペプチド）の配列はイタリック体で示され、プロドメインの配列は
下線が引かれ
、ＩＧＦ－Ｉコードドメインは太字で示され、ストップコドンは
太字
で示されている。（Ｂ）は、ウリジンがＮ１－メチルシュードウリジンである、ヒトＩＧＦ１のプレドメイン、プロドメインおよびコードドメインのＲＮＡ配列を図示する（配列番号２）。プレドメインおよびプロドメインは分泌時に切断される。
Ｃｐｄ．２のＤＮＡおよびＲＮＡ配列を示す図である。（Ａ）は、ＩＧＦ２プレドメインならびにＩＧＦ１プロドメインおよびコードドメインを含有するヒトコドン最適化ＩＧＦ１のＤＮＡ配列（配列番号３）を示す。プレドメイン（シグナル伝達ペプチド）の配列はイタリック体で示され、プロドメインの配列は
下線が引かれ
、ＩＧＦ１コードドメインは太字で示され、ストップコドンは
太字
で示されている。（Ｂ）は、ウリジンがＮ１－メチルシュードウリジンである、ＩＧＦ２プレドメインならびにＩＧＦ１プロドメインおよびコードドメインのＲＮＡ配列を図示する（配列番号４）。プレドメインおよびプロドメインは分泌時に切断される。
Ｃｐｄ．３のＤＮＡおよびＲＮＡ配列を示す図である。（Ａ）は、ＡＬＢプレドメインならびにＩＧＦ１プロドメインおよびコードドメインを含有するヒトコドン最適化ＩＧＦ１のＤＮＡ配列（配列番号５）を示す。プレドメイン（シグナル伝達ペプチド）の配列はイタリック体で示され、プロドメインの配列は
下線が引かれ
、ＩＧＦ１コードドメインは太字で示され、ストップコドンは
太字
で示されている。（Ｂ）は、ウリジンがＮ１－メチルシュードウリジンである、ＡＬＢプレドメインおよびＩＧＦ１プロドメインおよびコードドメインのＲＮＡ配列を図示する（配列番号６）。プレドメインおよびプロドメインは分泌時に切断される。
Ｃｐｄ．４のＤＮＡおよびＲＮＡ配列を示す図である。（Ａ）は、ＢＤＮＦプレドメインならびにＩＧＦ１プロドメインおよびコードドメインを含有するヒトコドン最適化ＩＧＦ１のＤＮＡ配列（配列番号７）を示す。プレドメイン（シグナル伝達ペプチド）の配列はイタリック体で示され、プロドメインの配列は
下線が引かれ
、ＩＧＦ１コードドメインは太字で示され、ストップコドンは
太字
で示されている。（Ｂ）は、ウリジンがＮ１－メチルシュードウリジンである、ＢＤＮＦプレドメインならびにＩＧＦ１プロドメインおよびコードドメインのＲＮＡ配列を図示する（配列番号８）。プレドメインおよびプロドメインは分泌時に切断される。
Ｃｐｄ．５のＤＮＡおよびＲＮＡ配列を示す図である。（Ａ）は、ＣＸＣＬ１２プレドメインならびにＩＧＦ１プロドメインおよびコードドメインを含有するヒトコドン最適化ＩＧＦ１のＤＮＡ配列（配列番号９）を示す。プレドメイン（シグナル伝達ペプチド）の配列はイタリック体で示され、プロドメインの配列は
下線が引かれ
、ＩＧＦ１コードドメインは太字で示され、ストップコドンは
太字
で示されている。（Ｂ）は、ウリジンがＮ１－メチルシュードウリジンである、ＣＸＣＬ１２プレドメインならびにＩＧＦ１プロドメインおよびコードドメインのＲＮＡ配列を図示する（配列番号１０）。プレドメインおよびプロドメインは分泌時に切断される。
Ｃｐｄ．６のＤＮＡおよびＲＮＡ配列を示す図である。（Ａ）は、合成シグナル伝達ペプチド１プレドメインならびにＩＧＦ１プロドメインおよびコードドメインを含有するヒトコドン最適化ＩＧＦ１のＤＮＡ配列（配列番号１１）を示す。プレドメイン（シグナル伝達ペプチド）の配列はイタリック体で示され、プロドメインの配列は
下線が引かれ
、ＩＧＦ１コードドメインは太字で示され、ストップコドンは
太字
で示されている。（Ｂ）は、ウリジンがＮ１－メチルシュードウリジンである、合成シグナル伝達ペプチド１プレドメインならびにＩＧＦ１プロドメインおよびコードドメインのＲＮＡ配列を図示する（配列番号１２）。プレドメインおよびプロドメインは分泌時に切断される。
Ｃｐｄ．７のＤＮＡおよびＲＮＡ配列を示す図である。（Ａ）は、合成シグナル伝達ペプチド２プレドメインならびにＩＧＦ１プロドメインおよびコードドメインを含有するヒトコドン最適化ＩＧＦ１のＤＮＡ配列（配列番号１３）を示す。プレドメイン（シグナル伝達ペプチド）の配列はイタリック体で示され、プロドメインの配列は
下線が引かれ
、ＩＧＦ１コードドメインは太字で示され、ストップコドンは
太字
で示されている。（Ｂ）は、ウリジンがＮ１－メチルシュードウリジンである、合成シグナル伝達ペプチド２プレドメインならびにＩＧＦ１プロドメインおよびコードドメインのＲＮＡ配列を図示する（配列番号１４）。プレドメインおよびプロドメインは分泌時に切断される。
太字
でマークされたＣｐｄ．１インサートを含むベクターｐＶＡＸ．Ａ１２０のＤＮＡ配列を示す図である（配列番号１５）。Ｃｐｄ．１のＯＲＦは、その元のプラスミドから消化され、ベクターにサブクローニングされた。
太字
でマークされたＣｐｄ．２インサートを含むベクターｐＭＡ－ＴのＤＮＡ配列を示す図である（配列番号１６）。Ｃｐｄ．２のＯＲＦは、その元のプラスミドから消化され、ベクターにサブクローニングされた。
太字
でマークされたＣｐｄ．３インサートを含むベクターｐＭＡ－ＴのＤＮＡ配列を示す図である（配列番号１７）。Ｃｐｄ．３のＯＲＦは、その元のプラスミドから消化され、ベクターにサブクローニングされた。
太字
でマークされたＣｐｄ．４インサートを含むベクターｐＭＡ－ＴのＤＮＡ配列を示す図である（配列番号１８）。Ｃｐｄ．４のＯＲＦは、その元のプラスミドから消化され、ベクターにサブクローニングされた。
太字
でマークされたＣｐｄ．５インサートを含むベクターｐＭＡ－ＴのＤＮＡ配列を示す図である（配列番号１９）。Ｃｐｄ．５のＯＲＦは、その元のプラスミドから消化され、ベクターにサブクローニングされた。
太字
でマークされたＣｐｄ．６を含むベクターｐＭＡ－ＲＱのＤＮＡ配列を示す図である（配列番号２０）。Ｃｐｄ．６のＯＲＦは、その元のプラスミドから消化され、ベクターにサブクローニングされた。
太字
でマークされたＣｐｄ．７を含むベクターｐＭＡ－ＲＱのＤＮＡ配列を示す図である（配列番号２１）。Ｃｐｄ．７のＯＲＦは、その元のプラスミドから消化され、ベクターにサブクローニングされた。
ｍＲＮＡのＩＶＴ用ｐＭＡ－ＴおよびｐＭＡ－ＲＱプラスミドを増幅するのに使用されるフォワード（配列番号２２）およびリバースプライマー（配列番号２３）配列を示す図である。
Ｃｐｄ．１～Ｃｐｄ．７のシグナルペプチドの遺伝子名、ＵｎｉＰｒｏｔ数、コドン最適化ＤＮＡ配列およびアミノ酸配列ならびにベクター（配列番号２４～３７）を示す図である。Ｃｐｄ．６およびＣｐｄ．７のシグナルペプチドは合成ペプチドであり、公開データベース中の一致する既知のタンパク質配列ではないことに注意。
Ｃｐｄ．１～Ｃｐｄ．７のｍＲＮＡトランスフェクションによる、ヒト胎児性腎細胞（ＨＥＫ２９３Ｔ）からのＩＧＦ１分泌の誘導を示す図である。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞は各２μｇＣｐ．１～Ｃｐｄ．７をトランスフェクトされ、分泌されたＩＧＦ１は、特異的ＥＬＩＳＡを使用して２４時間後に細胞培養上清で測定された。Ｃｐｄ．４は、Ｃｐｄ．１より有意に高いＩＧＦ１分泌を誘導した（３．３倍）。データは、４つの複製物の平均±平均の標準誤差を表す。有意性（
＊＊＊
、＜０．００１）は、一方向ＡＮＯＶＡとその後のダネットの多重比較検定によって評価された。
Ｃｐｄ．１またはＣｐｄ．４のｍＲＮＡトランスフェクション後のＨＥＫ２９３Ｔ細胞でのＩＧＦ１分泌の誘導の濃度依存性を示す図である。細胞は、種々の濃度（０、０．０２、０．０６、０．２、０．６または２μｇ）でＣｐｄ．１またはＣｐｄ．４をトランスフェクトされ、分泌されたＩＧＦ１は、特異的ＥＬＩＳＡを使用して２４時間後に細胞培養上清で測定された。Ｃｐｄ．４誘導ＩＧＦ１分泌は、Ｃｐｄ．１（ＥＣ
５０
０．８８９μｇ）より有意に強力であった（ＥＣ
５０
０．１３４μｇ）。データは、２つの複製物の平均±平均の標準誤差を表す。有意性（
＊＊＊
、＜０．００１）は、２つの曲線の二方向ＡＮＯＶＡによって評価された。
Ｃｐｄ．１～Ｃｐｄ．７のｍＲＮＡトランスフェクションによる、マウス骨格筋細胞（Ｃ２Ｃ１２）からのＩＧＦ１分泌の誘導を示す図である。Ｃ２Ｃ１２細胞は各２μｇＣｐ．１～Ｃｐｄ．７をトランスフェクトされ、分泌されたＩＧＦ１は、特異的ＥＬＩＳＡを使用して２４時間後に細胞培養上清で測定された。Ｃｐｄ．４は、Ｃｐｄ．１より有意に高いＩＧＦ１分泌を誘導した（６．１倍）。データは、４つの複製物の平均±平均の標準誤差を表す。有意性（
＊＊＊
、＜０．００１）は、一方向ＡＮＯＶＡとその後のダネットの多重比較検定によって評価された。
Ｃｐｄ．１およびＣｐｄ．４のｍＲＮＡトランスフェクションによる、ヒト初代骨格筋細胞（ＨＳｋＭＣ）からのＩＧＦ１分泌の誘導を示す図である。ＨＳｋＭＣ細胞は各２μｇＣｐ．１またはＣｐｄ．４をトランスフェクトされ、分泌されたＩＧＦ１は、特異的ＥＬＩＳＡを使用して２４時間後に細胞培養上清で測定された。Ｃｐｄ．４は、Ｃｐｄ．１より有意に高いＩＧＦ１分泌を誘導した（３．１倍）。データは、３つの複製物の平均±平均の標準誤差を表す。有意性（
＊＊
、ｐ＜０．０１）は、一方向ＡＮＯＶＡとその後のダネットの多重比較検定によって評価された。
ノテキシン損傷後の前脛骨筋（ＴＡ）の機能回復を示す図である。筋肉内注射（０日目）によるノテキシン損傷後、２つのＩＧＦ－ＩｍＲＮＡ処置（Ｃｐｄ．４（１μｇ））が１日目および４日目の筋肉内注射によって適用された（矢印の頭を参照）。対照群はビヒクル溶液を受け取った。筋機能は、損傷後１、４、７、１０、１４、２１および２８日目に評価された。データは、１群および１時点あたり５マウスの平均±平均の標準誤差（ＳＥＭ）を表す。アスタリスクは、スチューデントのｔ検定によって評価された場合のＣｐｄ．４処置群と対照群との有意差（ｐ＜０．０５）を示す。
対照としてのＣｐｄ．１およびＣｐｄ．８～Ｃｐｄ．２６のｍＲＮＡトランスフェクションによる、ヒト胎児性腎細胞（ＨＥＫ２９３Ｔ）からのＩＧＦ１分泌の誘導を示す図である。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞は各０．３μｇＣｐｄ．１およびＣｐｄ．８～Ｃｐｄ．２６をトランスフェクトされ、分泌されたＩＧＦ１は、特異的ＥＬＩＳＡを使用して２４時間後に細胞培養上清で測定された。ＩＧＦ１分泌はＣｐｄ．１ＩＧＦ１分泌に対して正規化された。Ｃｐｄ．８、９、１０、１１、１２および１３はＩＧＦ１分泌の低下を示したのに対し、Ｃｐｄ．１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２３、２４、２５および２６はＣｐｄ．１より高いＩＧＦ１分泌を誘導した（最大２．６倍）。データは、１Ｃｐｄ．につき２～１１の複製物の平均±平均の標準誤差を表す。有意性（
＊
、ｐ＜０．０５；
＊＊
、ｐ＜０．００１；
＊＊＊
、＜０．００１）は、Ｃｐｄ．１と比較した個々のＣｐｄ．のスチューデントのｔ検定によって評価された。
対照としてのＣｐｄ．１およびＣｐｄ．４～Ｃｐｄ．２６のｍＲＮＡトランスフェクションによる、ヒト肝細胞（ＨｅｐＧ２）からのＩＧＦ１分泌の誘導を示す図である。ＨｅｐＧ２細胞は各０．３μｇＣｐ．１およびＣｐｄ．４～Ｃｐｄ．２６をトランスフェクトされ、分泌されたＩＧＦ１は、特異的ＥＬＩＳＡを使用して２４時間後に細胞培養上清で測定された。ＩＧＦ１分泌はＣｐｄ．１に対して正規化された。Ｃｐｄ．８、９および１２はＩＧＦ１分泌の低下を示したのに対し、Ｃｐｄ．４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５および２６はＣｐｄ．１より高いＩＧＦ１分泌を誘導した（最大８．３倍）。データは、１Ｃｐｄ．につき２～４つの複製物の平均±平均の標準誤差を表す。有意性（
＊＊
、ｐ＜０．０１；
＊＊＊
、＜０．００１）は、Ｃｐｄ．１と比較した個々のＣｐｄ．のスチューデントのｔ検定によって評価された。
対照としてのＣｐｄ．１およびＣｐｄ．４～Ｃｐｄ．２４のｍＲＮＡトランスフェクションによる、ヒト神経細胞（ＩＭＲ３２）からのＩＧＦ１分泌の誘導を示す図である。ＩＭＲ３２細胞は各０．３μｇＣｐ．１およびＣｐｄ．４～Ｃｐｄ．２４をトランスフェクトされ、分泌されたＩＧＦ１は、特異的ＥＬＩＳＡを使用して２４時間後に細胞培養上清で測定された。ＩＧＦ１分泌はＣｐｄ．１に対して正規化された。Ｃｐｄ．４、１４、１５、１６、１７、２０、２２、２３および２４はＣｐｄ．１より高いＩＧＦ１分泌を誘導した（最大２．６倍）。データは、１Ｃｐｄ．につき２～６つの複製物の平均±平均の標準誤差を表す。有意性（
＊
、ｐ＜０．０５；
＊＊＊
、＜０．００１）は、Ｃｐｄ．１と比較した個々のＣｐｄ．のスチューデントのｔ検定によって評価された。
対照としてのＣｐｄ．１およびＣｐｄ．４～Ｃｐｄ．２５のｍＲＮＡトランスフェクションによる、ヒト初代軟骨細胞からのＩＧＦ１分泌の誘導を示す図である。軟骨細胞は各０．６μｇＣｐ．１およびＣｐｄ．４～Ｃｐｄ．２５をトランスフェクトされ、分泌されたＩＧＦ１は、特異的ＥＬＩＳＡを使用して２４時間後に細胞培養上清で測定された。ＩＧＦ１分泌はＣｐｄ．１に対して正規化された。Ｃｐｄ．４、１４、１５、１６、２０、２１、２２、２４および２５はＣｐｄ．１より高いＩＧＦ１分泌を誘導した（最大１．９倍）。データは、１Ｃｐｄ．につき１～２つの複製物の平均±平均の標準誤差を表す。有意性（
＊
、ｐ＜０．０５；
＊＊＊
、＜０．００１）は、Ｃｐｄ．１と比較した個々のＣｐｄ．のスチューデントのｔ検定によって評価された。
対照としてのＣｐｄ．１およびＣｐｄ．４～Ｃｐｄ．１７のｍＲＮＡトランスフェクションによる、ラット野生型（Ａ）またはＳＯＤ１Ｇ
Ｓ９３Ａ
（Ｂ）初代運動ニューロンからのＩＧＦ１分泌の誘導を示す図である。ラット野生型初代運動ニューロンは、各０．３μｇＣｐ．１、Ｃｐｄ．４、Ｃｐｄ．１４およびＣｐｄ．１７をトランスフェクトされ、ラットＳＯＤ１Ｇ
Ｓ９３Ａ
初代運動ニューロンは、各０．３μｇＣｐ．１、Ｃｐｄ．１４およびＣｐｄ．１７をトランスフェクトされ、分泌されたＩＧＦ１は、特異的ＥＬＩＳＡを使用して４８時間後に細胞培養上清で測定された。ＩＧＦ１分泌はＣｐｄ．１に対して正規化された。Ｃｐｄ．４、１４および１７はＣｐｄ．１より高いＩＧＦ１分泌を誘導した（野生型で最大４．３倍またはＳＯＤ１
Ｓ９３Ａ
で９．３倍）。データは、１Ｃｐｄ．につき２つの複製物の平均±平均の標準誤差を表す。有意性は、Ｃｐｄ．１と比較した個々のＣｐｄ．のスチューデントのｔ検定によって評価され、統計的差異がないことを明らかにした。
Ｃｐｄ．２７、Ｃｐｄ．２８またはＣｐｄ．２９のｍＲＮＡトランスフェクションによる、ヒト胎児性腎細胞（ＨＥＫ２９３Ｔ、Ａ）、ヒト肝細胞（ＨｅｐＧ２、Ｂ）およびヒト肺癌細胞（Ａ５４９、Ｃ）からのＥＰＯ分泌の誘導を示す図である。細胞は各０．３～０．９μｇＣｐ．２７、Ｃｐｄ．２８またはＣｐｄ．２９をトランスフェクトされ、分泌されたＥＰＯは、特異的ＥＬＩＳＡを使用して２４時間後に細胞培養上清で測定された。ＥＰＯ分泌はＣｐｄ．２７に対して正規化された。Ｃｐｄ．２８および２９は、分析された３つの細胞型全てにおいてＣｐｄ．２７より高いＥＰＯ分泌を誘導した（最大１．８倍）。データは、１Ｃｐｄ．につき３～８つの複製物の平均±平均の標準誤差を表す。有意性（
＊
、ｐ＜０．０５；
＊＊＊
、＜０．００１）は、Ｃｐｄ．２７と比較した個々のＣｐｄ．のスチューデントのｔ検定によって評価された。
Ｃｐｄ．３０、Ｃｐｄ．３１またはＣｐｄ．３２のｍＲＮＡトランスフェクションによる、ヒト胎児性腎細胞（ＨＥＫ２９３Ｔ）からのＩＮＳ分泌の誘導を示す図である。細胞は各０．６μｇＣｐ．３０、Ｃｐｄ．３１またはＣｐｄ．３２をトランスフェクトされ、分泌されたＩＮＳは、特異的ＥＬＩＳＡを使用して２４時間後に細胞培養上清で測定された。ＩＮＳ分泌はＣｐｄ．３０に対して正規化された。Ｃｐｄ．３１および３２はＣｐｄ．３０より高いＩＮＳ分泌を誘導した（最大３．９倍）。データは、１Ｃｐｄ．につき３～５つの複製物の平均±平均の標準誤差を表す。有意性（
＊
、ｐ＜０．０５；
＊＊＊
、＜０．００１）は、Ｃｐｄ．３０と比較した個々のＣｐｄ．のスチューデントのｔ検定によって評価された。
Ｃｐｄ．３３、Ｃｐｄ．３４またはＣｐｄ．３５のｍＲＮＡトランスフェクションによる、ヒト胎児性腎細胞（ＨＥＫ２９３Ｔ、Ａ）、ヒト肝細胞（ＨｅｐＧ２、Ｂ）、ヒト単球（ＴＨＰ－１、Ｃ）およびヒト肺癌細胞（Ａ５４９、Ｄ）からのＩＬ４分泌の誘導を示す図である。細胞は各０．５～０．６μｇＣｐ．３３、Ｃｐｄ．３４またはＣｐｄ．３５をトランスフェクトされ、分泌されたＩＬ４は、特異的ＥＬＩＳＡを使用して２４時間後に細胞培養上清で測定された。ＩＬ４分泌はＣｐｄ．３３に対して正規化された。Ｃｐｄ．３４および３５は、分析された３つの細胞型全てにおいてＣｐｄ．３３より高いＩＬ４分泌を誘導した。ｉｎ（最大２．２倍）。データは、１Ｃｐｄ．につき３～８つの複製物の平均±平均の標準誤差を表す。有意性（
＊
、ｐ＜０．０５；
＊＊＊
、＜０．００１）は、Ｃｐｄ．３３と比較した個々のＣｐｄ．のスチューデントのｔ検定によって評価された。
Ｃｐｄ．３６、Ｃｐｄ．３７またはＣｐｄ．３８のｍＲＮＡトランスフェクションによる、ヒト胎児性腎細胞（ＨＥＫ２９３Ｔ、Ａ）、ヒト肝細胞（ＨｅｐＧ２、Ｂ）またはヒト単球（ＴＨＰ－１、Ｃ）からのＩＬ１０分泌の誘導を示す図である。細胞は各０．３～０．６μｇＣｐ．３６、Ｃｐｄ．３７またはＣｐｄ．３８をトランスフェクトされ、分泌されたＩＬ１０は、特異的ＥＬＩＳＡを使用して２４時間後に細胞培養上清で測定された。ＩＬ１０分泌はＣｐｄ．３６に対して正規化された。Ｃｐｄ．３７および３８は、分析された３つの細胞型全てにおいてＣｐｄ．３６より高いＩＬ１０分泌を誘導した（最大２．２倍）。データは、１Ｃｐｄ．につき４～８つの複製物の平均±平均の標準誤差を表す。有意性（
＊＊
、ｐ＜０．０１；
＊＊＊
、＜０．００１）は、Ｃｐｄ．３６と比較した個々のＣｐｄ．のスチューデントのｔ検定によって評価された。
Ｃｐｄ．３９のｍＲＮＡトランスフェクションによる、ヒト肝細胞（ＨｅｐＧ２、Ａ）およびヒト初代軟骨細胞（Ｂ）からのＩＧＦ－１分泌の誘導を示す図である。細胞は各０．３～０．６μｇＣｐ．３９をトランスフェクトされ、分泌ＩＧＦ１は、特異的ＥＬＩＳＡを使用して２４時間後に細胞培養上清で測定された。ＩＧＦ１分泌はＣｐｄ．１に対して正規化された。Ｃｐｄ．３９は、分析された２つの細胞型全てにおいてＣｐｄ．１より高いＩＧＦ１分泌を誘導した（最大１．４倍）。データは、４～７つの複製物の平均±平均の標準誤差を表す。有意性（
＊＊
、ｐ＜０．０１；
＊＊＊
、＜０．００１）は、Ｃｐｄ．３９と比較した個々のＣｐｄ．１のスチューデントのｔ検定によって評価された。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
用語「ＲＮＡ」は、本明細書で使用される場合、アミノ酸配列をコードするＲＮＡ、加えて、アミノ酸配列をコードしないＲＮＡを含む。通常、本明細書で使用されるようなＲＮＡは、コードＲＮＡであり、すなわちアミノ酸配列をコードするＲＮＡである。このようなＲＮＡ分子はまた、ｍＲＮＡ（メッセンジャーＲＮＡ）とも称され、一本鎖ＲＮＡ分子である。したがって、用語「ＲＮＡ」は、本明細書で使用される場合、好ましくはｍＲＮＡを指す。ＲＮＡは、当業者公知の化学的および酵素的な合成手法によって、または組換え技術の使用によって作製してもよいし、または天然源から単離してもよいし、またはそれらの組合せであってもよい。ＲＮＡは、必要に応じて、天然にはない、および天然に存在するヌクレオシド修飾、例えば、本明細書ではメチルプソイドウリジンとも称されるＮ
１
－メチルプソイドウリジンなどを含んでいてもよい。
（【００１１】以降は省略されています）

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