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公開番号2024169303
公報種別公開特許公報(A)
公開日2024-12-05
出願番号2024026427
出願日2024-02-26
発明の名称耐アルカリ性の向上したアデノ随伴ウイルス結合性タンパク質
出願人東ソー株式会社
代理人
主分類C12N 15/12 20060101AFI20241128BHJP(生化学;ビール;酒精;ぶどう酒;酢;微生物学;酵素学;突然変異または遺伝子工学)
要約【課題】耐アルカリ性が向上した、改良アデノ随伴ウイルス(AAV)結合性タンパク
質を提供すること。
【解決の手段】 KIAA0319L(UniProt No.Q8IZA0)の細胞外
領域ドメイン1(PKD1)およびドメイン2(PKD2)に相当する領域中の特定位置
にあるアミノ酸残基を他の特定のアミノ酸残基に置換することで、前記課題を解決する。
【選択図】図1
特許請求の範囲【請求項１】
以下の（ｉ）から（ｉｉｉ）のいずれかから選択されるＡＡＶ結合性タンパク質：
（ｉ）配列番号２に記載のアミノ酸配列のうち２５番目のセリンから２１３番目のアスパラギン酸までのアミノ酸残基を少なくとも含み、ただし当該２５番目から２１３番目
までのアミノ酸残基において以下の（１）から（２）のうち少なくともいずれか１つの
アミノ酸置換が生じ、かつＡＡＶ結合活性を有するＡＡＶ結合性タンパク質；
（１）配列番号２の１０２番目のヒスチジンがチロシンに置換
（２）配列番号２の１９３番目のバリンがスレオニンに置換
（ｉｉ）配列番号２に記載のアミノ酸配列のうち２５番目のセリンから２１３番目のアスパラギン酸までのアミノ酸残基を少なくとも含み、ただし当該２５番目から２１３番目までのアミノ酸残基において前記（１）から（２）のうち少なくともいずれか１つのアミノ酸置換が生じており、さらに前記（１）から（２）に示すアミノ酸置換以外に１もしくは数個の位置での１もしくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入および付加のうち、いずれか１つ以上さらに生じ、かつＡＡＶ結合活性を有するＡＡＶ結合性タンパク質；
（ｉｉｉ）配列番号２に記載のアミノ酸配列のうち２５番目のセリンから２１３番目のアスパラギン酸までのアミノ酸配列において、前記（１）から（２）のうち少なくともいずれか１つのアミノ酸置換が生じたアミノ酸配列全体に対して７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列であって、前記少なくともいずれか１つのアミノ酸置換が残存したアミノ酸配列を含み、かつＡＡＶ結合活性を有するＡＡＶ結合性タンパク質。
続きを表示（約 1,800 文字）【請求項２】
さらに以下の（３）に示すアミノ酸置換が少なくとも生じた、請求項１に記載のＡＡＶ結合性タンパク質；
（３）配列番号２の１８０番目のグルタミンがアスパラギンに置換
【請求項３】
配列番号２に記載のアミノ酸配列のうち２５番目のセリンから２１３番目のアスパラギン酸までのアミノ酸残基を少なくとも含み、ただし当該２５番目から２１３番目までのアミノ酸残基において、以下の（Ａ）から（Ｄ）に示すいずれかのアミノ酸置換が少なくとも生じ、かつＡＡＶ結合活性を有する、請求項２に記載のＡＡＶ結合性タンパク質；
（Ａ）配列番号２の４２番目のアスパラギンがリジンに置換し、配列番号２の１０２番目のヒスチジンがチロシンに置換し、配列番号２の１１４番目のグルタミン酸がグリシンに置換し、配列番号２の１３９番目のスレオニンがアラニンに置換し、配列番号２の１７４番目のアラニンがプロリンに置換し、配列番号２の１８０番目のグルタミンがアスパラギンに置換し、かつ配列番号２の１９３番目のバリンがスレオニンに置換
（Ｂ）配列番号２の４２番目のアスパラギンがリジンに置換し、配列番号２の７９番目のイソロイシンがフェニルアラニンに置換し、配列番号２の１０７番目のバリンがアラニンに置換し、配列番号２の１１４番目のグルタミン酸がグリシンに置換し、配列番号２の１３９番目のスレオニンがアラニンに置換し、配列番号２の１６８番目のリジンがアルギニンに置換し、配列番号２の１７４番目のアラニンがプロリンに置換し、配列番号２の１８０番目のグルタミンがアスパラギンに置換し、配列番号２の１９３番目のバリンがスレオニンに置換し、かつ配列番号２の２１０番目のリジンがグルタミン酸に置換
（Ｃ）配列番号２の４２番目のアスパラギンがリジンに置換し、配列番号２の７９番目のイソロイシンがフェニルアラニンに置換し、配列番号２の１０２番目のヒスチジンがチロシンに置換し、配列番号２の１０７番目のバリンがアラニンに置換し、配列番号２の１１４番目のグルタミン酸がグリシンに置換し、配列番号２の１３９番目のスレオニンがアラニンに置換し、配列番号２の１６８番目のリジンがアルギニンに置換し、配列番号２の１７４番目のアラニンがプロリンに置換し、配列番号２の１８０番目のグルタミンがアスパラギンに置換し、かつ配列番号２の２１０番目のリジンがグルタミン酸に置換
（Ｄ）配列番号２の４２番目のアスパラギンがリジンに置換し、配列番号２の７９番目のイソロイシンがフェニルアラニンに置換し、配列番号２の１０２番目のヒスチジンがチロシンに置換し、配列番号２の１０７番目のバリンがアラニンに置換し、配列番号２の１１４番目のグルタミン酸がグリシンに置換し、配列番号２の１３９番目のスレオニンがアラニンに置換し、配列番号２の１６８番目のリジンがアルギニンに置換し、配列番号２の１７４番目のアラニンがプロリンに置換し、配列番号２の１８０番目のグルタミンがアスパラギンに置換し、配列番号２の１９３番目のバリンがスレオニンに置換し、かつ配列番号２の２１０番目のリジンがグルタミン酸に置換。
【請求項４】
請求項１から３のいずれかに記載のＡＡＶ結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【請求項５】
請求項４に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
【請求項６】
請求項５に記載の発現ベクターで大腸菌を形質転換して得られる形質転換体。
【請求項７】
請求項６に記載の形質転換体を培養することによりＡＡＶ結合性タンパク質を発現させる工程と、得られた培養物から発現されたＡＡＶ結合性タンパク質を回収する工程とを含む、ＡＡＶ結合性タンパク質の製造方法。
【請求項８】
不溶性担体と、当該担体に固定化した請求項１から３のいずれかに記載のＡＡＶ結合性タンパク質とを含む、ＡＡＶ吸着剤。
【請求項９】
請求項８に記載のＡＡＶ吸着剤を含むカラム。
【請求項１０】
請求項９に記載のカラムにＡＡＶを含む溶液を添加して当該ＡＡＶを前記吸着剤に吸着させる工程と、前記吸着剤に吸着したＡＡＶを溶出液を用いて溶出させる工程とを含む、ＡＡＶの精製または分析方法。
（【請求項１１】以降は省略されています）
発明の詳細な説明【技術分野】
【０００１】
本発明は、アデノ随伴ウイルス（Ａｄｅｎｏ－ＡｓｓｏｃｉａｔｅｄＶｉｒｕｓ：ＡＡＶ）に結合性を有するタンパク質に関する。より詳しくは、本発明は、耐アルカリ性の向上した、改良ＡＡＶ結合性タンパク質に関する。
続きを表示（約 1,700 文字）【背景技術】
【０００２】
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）はパルボウイルス科（Ｐａｒｖｏｖｉｒｉｄａｅ）、ディペンドウイルス属（Ｄｅｐｅｎｄｏｖｉｒｕｓ）に分類される非エンベロープウイルスである。ＡＡＶ外殻粒子は３種類のタンパク質（ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３）で構成されており、約６０のタンパク質分子がおよそＶＰ１：ＶＰ２：ＶＰ３＝１：１：１０の比率で混在し集合することで、直径２０ｎｍから３０ｎｍの正二十面体の形状をしている。
【０００３】
自然界でのＡＡＶは自立性の増殖能を欠き、複製はアデノウイルスやヘルペスウイルスなどのヘルパーウイルスに依存する。前記ヘルパーウイルスが存在すると、ＡＡＶゲノムは宿主細胞内で複製され、ＡＡＶゲノムを含む完全なＡＡＶ粒子が形成され、宿主細胞からＡＡＶ粒子が放出される。一方、前記ヘルパーウイルスが存在しない場合、ＡＡＶゲノムはエピソームに維持された状態または宿主染色体に組込まれた状態（潜伏状態）となる。
【０００４】
ＡＡＶはヒトを含む広範な種の細胞に感染可能で、血球、筋、神経細胞などの分化を終えた非分裂細胞にも感染すること、ヒトに対する病原性がないため副作用の心配が低いこと、ウイルス粒子が物理化学的に安定であること、などから、先天性遺伝子疾患の治療を目的とした遺伝子導入用のベクターとしての利用価値が注目されている。
【０００５】
遺伝子組換えＡＡＶベクター（以下、単に「ＡＡＶベクター」とも表記）の製造は、通常、ＡＡＶ粒子形成に必須な要素をコードする核酸を細胞に導入することで、ＡＡＶを産生する能力を有する細胞（以下、ＡＡＶ産生細胞とも表記）を作製し、当該細胞を培養してＡＡＶ粒子形成に必須な要素を発現させることで行なう。製造したＡＡＶベクターはＡＡＶ産生細胞から回収精製し、治療用ＡＡＶベクター製剤を得る。
【０００６】
ＡＡＶ産生細胞からＡＡＶベクターを回収精製する方法として、不溶性担体と当該担体に固定化したＡＡＶ結合性タンパク質とを含む吸着剤を用いた、ＡＡＶとの結合親和性に基づくアフィニティークロマトグラフィによる方法があり、夾雑物質が共存したＡＡＶベクターを含む溶液から当該ベクターを回収精製できる。具体例として、特許文献１には、ＫＩＡＡ０３１９Ｌ（ＵｎｉＰｒｏｔＮｏ．Ｑ８ＩＺＡ０）の細胞外領域ドメイン１（ＰＫＤ１）およびドメイン２（ＰＫＤ２）を含み、ただしこれらドメイン中の特定位置にあるアミノ酸残基を他のアミノ酸残基に置換することで、熱、酸およびアルカリに対する安定性が向上したポリペプチドを、不溶性担体に固定化するＡＡＶ結合性タンパク質（以下、単に「リガンドタンパク質」とも表記）として用いることで、ＡＡＶベクターの高純度な精製を実現している。
【０００７】
一方で、上記吸着剤を精製用途として用いる場合、ＡＡＶ精製後は通常、残存したＡＡＶや夾雑物質を高濃度（例えば０．１Ｍ以上０．５Ｍ以下）の水酸化ナトリウム水溶液を使用してアルカリ洗浄する。したがって、当該アルカリ洗浄に耐えうるリガンドタンパク質の創製が望まれていた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
ＷＯ２０２１／１０６８８２号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
前述した通り、ＷＯ２０２１／１０６８８２号でリガンドタンパク質として用いたアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）結合性タンパク質は、天然型（アミノ酸置換がないＡＡＶ結合性タンパク質）よりも熱、酸およびアルカリに対する安定性が向上している。一方で、前記公報で開示のＡＡＶ結合性タンパク質よりもアルカリ洗浄に耐えうるリガンドタンパク質が求められた。
【００１０】
つまり本発明の課題は、前記公報で開示のＡＡＶ結合性タンパク質よりも耐アルカリ性の向上したＡＡＶ結合性タンパク質を提供することである。
【課題を解決するための手段】
（【００１１】以降は省略されています）

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