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公開番号2024123940
公報種別公開特許公報(A)
公開日2024-09-12
出願番号2023031784
出願日2023-03-02
発明の名称ウイルスベクターの製造方法
出願人国立大学法人京都大学
代理人個人,個人
主分類C12N 15/64 20060101AFI20240905BHJP(生化学;ビール;酒精;ぶどう酒;酢;微生物学;酵素学;突然変異または遺伝子工学)
要約【課題】本開示の目的は、培養細胞を用いるウイルスベクターの製造において、ウイルスベクターの生産量を高めることである。
【解決手段】ウイルスベクターの製造方法であって、ウイルスベクターのウイルス粒子の産生に必要な核酸およびウイルスベクターにより送達しようとする核酸を含む細胞を、プロテインキナーゼC(PKC)を活性化する条件下で培養することを含み、ウイルス粒子の産生に必要な核酸が、SP1、CEBP、AP1、NF-κBおよびYY1から選択される少なくとも1つの転写因子の結合部位を含むプロモーターに作動可能に連結している、方法を提供する。
【選択図】図33
特許請求の範囲【請求項１】
ウイルスベクターの製造方法であって、ウイルスベクターのウイルス粒子の産生に必要な核酸およびウイルスベクターにより送達しようとする核酸を含む細胞を、プロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）を活性化する条件下で培養することを含み、
ウイルス粒子の産生に必要な核酸が、ＳＰ１、ＣＥＢＰ、ＡＰ１、ＮＦ－κＢおよびＹＹ１から選択される少なくとも１つの転写因子の結合部位を含むプロモーターに作動可能に連結している、方法。
続きを表示（約 2,000 文字）【請求項２】
ウイルスベクターが、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクターまたはアデノ随伴ウイルスベクターである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ウイルスベクターがレトロウイルスベクターである、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
ウイルスベクターにより送達しようとする核酸が、ＳＰ１、ＣＥＢＰ、ＡＰ１、ＮＦ－κＢおよびＹＹ１から選択される少なくとも１つの転写因子の結合部位を含むプロモーターに作動可能に連結している、請求項１～３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
ＰＫＣ活性化剤の存在下で前記細胞を培養することによりＰＫＣを活性化する、請求項１～４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
ＰＫＣ活性化剤が、式（Ｉ）：
TIFF
2024123940000012.tif
60
62
｛式中、
Ｒ
１
は、Ｈ、ハロゲン、－ＯＨ、Ｃ
１－６
アルキル、Ｃ
２－６
アルケニル、Ｃ
２－６
アルキニル、Ｃ
１－６
アルコキシ、Ｃ
６－１４
アリールまたは－ＯＣ（Ｏ）Ｒ
３
であり、ここで、Ｃ
１－６
アルキル、Ｃ
２－６
アルケニル、Ｃ
２－６
アルキニル、Ｃ
１－６
アルコキシまたはアリールは、同一または異なる、１個～３個のハロゲンにより置換されていてもよく、
Ｒ
２
は、Ｃ
６－１２
アルキル、Ｃ
６－１２
アルケニル、Ｃ
６－１２
アルキニルまたはＣ
６－１２
アルコキシであり、ここで、Ｃ
６－１２
アルキル、Ｃ
６－１２
アルケニル、Ｃ
６－１２
アルキニルまたはＣ
６－１２
アルコキシは、同一または異なる、１個～３個のハロゲンにより置換されていてもよく、
Ｒ
３
は、Ｃ
１－６
アルキル、Ｃ
２－６
アルケニル、Ｃ
２－６
アルキニル、アミノまたはＣ
６－１４
アリールであり、ここでＣ
１－６
アルキル、Ｃ
２－６
アルケニル、Ｃ
２－６
アルキニルまたはＣ
６－１４
アリールは、同一または異なる、１個～３個のハロゲンにより置換されていてもよい｝、
式（ＩＩ）：
TIFF
2024123940000013.tif
55
55
｛式中、
Ｒ
４
は、Ｈ、ハロゲン、－ＯＨ、Ｃ
１－１８
アルキル、Ｃ
２－１８
アルケニル、Ｃ
２－１８
アルキニル、Ｃ
１－１８
アルコキシまたは－ＯＣ（Ｏ）Ｒ
６
であり、ここで、Ｃ
１－１８
アルキル、Ｃ
２－１８
アルケニル、Ｃ
２－１８
アルキニルまたはＣ
１－１８
アルコキシは、同一または異なる、１個～３個のハロゲンにより置換されていてもよく、
Ｒ
５
は、Ｃ
１－６
【請求項７】
ＰＫＣ活性化剤が、
TIFF
2024123940000015.tif
130
164
ＴＰＡ、プロストラチン、（－）－インドラクタムＶ、ホルボール１２，１３－ジブチラート、インゲノール３－アンゲラートおよび（２Ｓ，５Ｓ）－（Ｅ，Ｅ）－８－（５－（４－（トリフルオロメチル）フェニル）－２，４－ペンタジエノイルアミノ）ベンゾラクタムから選択される化合物またはそのエステル、塩もしくは溶媒和物である、請求項５または６に記載の方法。
【請求項８】
ＰＫＣ活性化剤が、化合物Ｘおよび化合物＃１～＃７から選択される化合物またはそのエステル、塩もしくは溶媒和物である、請求項５～７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
ウイルス粒子の産生に必要な核酸が、Ｐｒｏ領域またはＲＩＮＧ領域を含むペプチドをコードする核酸と連結されている、請求項５～８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
活性化型ＰＫＣを前記細胞に発現させることによりＰＫＣを活性化する、請求項１～４のいずれかに記載の方法。
（【請求項１１】以降は省略されています）
発明の詳細な説明【技術分野】
【０００１】
本開示は、ウイルスベクターの製造方法に関するものである。
続きを表示（約 1,800 文字）【背景技術】
【０００２】
遺伝子治療は近年成長が期待されている分野である。遺伝子治療では、目的の遺伝子を細胞に送達するために、各種のベクターが使用される。ウイルスベクターはその１種であり、目的に応じてレトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクターなどが選択される。
【０００３】
ウイルスベクターは、抗体などの生物製剤（バイオ医薬品）と同様に、培養細胞を用いて製造される。通常、ウイルス粒子の産生に必要な核酸と、目的の遺伝子の核酸を培養細胞に発現させることにより、目的の遺伝子を含むウイルスベクターを産生させ、培養培地に放出されたウイルスベクターを回収する。従って、ウイルスベクターの生産量は、細胞のタンパク質生産能、培養容積および培養時間に依存する。細胞のタンパク質生産能を高めることができれば、製造コストを抑制しながらウイルスベクターの生産量を増加させられると期待される。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本開示の目的は、ウイルスベクターの生産量を高めることである。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは、ＰＫＣを活性化することにより、ＣＭＶプロモーターなどのプロモーターの転写活性を高められること、および、ＰＫＣを活性化する新たな方法を見出し、それにより培養細胞におけるウイルスベクターの生産量を高められることを明らかにした。
【０００６】
従って、ある態様では、本開示は、ウイルスベクターの製造方法であって、ウイルスベクターのウイルス粒子の産生に必要な核酸およびウイルスベクターにより送達しようとする核酸を含む細胞を、ＰＫＣを活性化する条件下で培養することを含み、
ウイルス粒子の産生に必要な核酸が、ＳＰ１、ＣＥＢＰ、ＡＰ１、ＮＦ－κＢおよびＹＹ１から選択される少なくとも１つの転写因子の結合部位を含むプロモーターに作動可能に連結している、方法を提供する。
【０００７】
ある態様では、本開示は、ＰＫＣ活性化剤または活性化型ＰＫＣをコードする核酸と、ウイルスベクターのウイルス粒子の産生に必要な核酸とを含む、ウイルスベクターを製造するためのキットであって、
ウイルス粒子の産生に必要な核酸が、ＳＰ１、ＣＥＢＰ、ＡＰ１、ＮＦ－κＢおよびＹＹ１から選択される少なくとも１つの転写因子の結合部位を含むプロモーターに作動可能に連結しているものである、キットを提供する。
【０００８】
ある態様では、本開示は、ＰＫＣ活性化剤または活性化型ＰＫＣをコードする核酸を含む、ウイルスベクターの産生を増強するための組成物を提供する。
【発明の効果】
【０００９】
本開示により、ウイルスベクターの生産量を高めることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
ｐＲＬ－ＣＭＶ（Renilla Luciferase）を恒常的に発現するＨＥＫ２９３Ａ細胞における、化合物Ｘまたは化合物＃１～＃７のいずれかの存在下、ＰＫＣ阻害剤の存在下または非存在下でのルシフェラーゼ活性を示す。
ｐＲＬ－ＣＭＶ（Renilla Luciferase）を恒常的に発現するＨＥＫ２９３Ａ細胞における、化合物Ｘの存在下または非存在下でのルシフェラーゼ活性の変化を示す。
ｐＲＬ－ＣＭＶ（Renilla Luciferase）を恒常的に発現するＨＥＫ２９３Ａ細胞における、化合物ＸまたはＰＫＣ活性化剤＃１～＃４のいずれかの存在下、ＰＫＣ阻害剤の存在下または非存在下でのルシフェラーゼ活性を示す。
ｐＲＬ－ＣＭＶ（Renilla Luciferase）を恒常的に発現するＨＥＫ２９３Ａ細胞における、化合物ＸまたはＰＫＣ活性化剤＃５～＃６のいずれかの存在下、ＰＫＣ阻害剤の存在下または非存在下でのルシフェラーゼ活性を示す。
ｐＲＬ－ＣＡＧまたはｐＲＬ－ＥＦ１をトランスフェクションしたＨＥＫ２９３Ａ細胞における、化合物Ｘまたは化合物＃１～＃５のいずれかの存在下、ＰＫＣ阻害剤の存在下または非存在下でのルシフェラーゼ活性を示す。
（【００１１】以降は省略されています）

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