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公開番号2024095710
公報種別公開特許公報(A)
公開日2024-07-10
出願番号2024050953,2021169192
出願日2024-03-27,2017-05-05
発明の名称胃底部組織のインビトロでの製造のための方法及び当該方法と関連した組成物
出願人チルドレンズホスピタルメディカルセンター
代理人個人
主分類C12N 5/071 20100101AFI20240703BHJP(生化学;ビール;酒精;ぶどう酒;酢;微生物学;酵素学;突然変異または遺伝子工学)
要約【課題】ヒトの胃の胃底部上皮を研究するための適切なモデルであるヒト胃底部オルガノイド(hFGO)を提供する。
【解決手段】a)MUC5AC陽性表面粘膜細胞及び/又はMUC6陽性粘膜頚細胞と、b)グレリン(GHRL)、ソマトスタチン(SST)、及び/又はヒスタミンを発現する内分泌細胞と、c)MIST1、ペプシノーゲンA(PGA5)、及び/又はペプシノーゲンC(PGC)を発現する主細胞と、d)傍細胞の密な腺と、及び/又はe)ATP4A、ATP4B、及びGIFを発現する傍細胞と、を特徴とする、ヒト胃底部オルガノイド(hFGO)とする。
【選択図】なし
特許請求の範囲【請求項１】
胃底部組織の形成を誘導するインビトロ方法であって、
ａ）哺乳類胚体内胚葉（ＤＥ）細胞を、ｗｎｔ経路活性化因子、ＦＧＦシグナル伝達経路活性化因子、ＢＭＰシグナル伝達経路阻害因子、及びレチノイン酸と第１の期間接触させるステップであって、
前記第１の期間は、前記胚体内胚葉から３次元後部前腸スフェロイドを形成するのに十分な長さの期間である、ステップと、
ｂ）前記３次元後部前腸スフェロイドを、基底膜マトリックス中で成長因子、前記Ｗｎｔシグナル伝達経路活性化因子、前記ＥＧＦシグナル伝達経路活性化因子、前記ＢＭＰシグナル伝達経路阻害因子、及びレチノイン酸とともに第２の期間懸濁させるステップであって、前記第２の期間は、胃底部ｈＧＯ（ｈＦＧＯ）を含む胃底部系譜を誘導するのに十分な長さの期間である、ステップと、
ｃ）ステップｂ）の前記ｈＦＧＯを前記ｗｎｔ経路活性化因子及び前記ＥＧＦシグナル伝達経路活性化因子とともに第３の期間培養するステップと、
ｄ）ステップｃの前記ｈＦＧＯを前記ｗｎｔシグナル伝達経路活性化因子、前記ＥＧＦシグナル伝達経路活性化因子、及びＦＧＦ１０とともに第４の期間培養するステップと、
ｅ）ステップｄの前記ｈＦＧＯをＭＥＫ阻害因子と第５の期間接触させるステップであって、前記第５の期間は、機能的胃底部細胞タイプを含む前記胃底部組織を形成するのに十分な期間である、ステップと、を含む、方法。
続きを表示（約 570 文字）【請求項２】
前記第１の期間は、３日間±２４時間であり、前記レチノイン酸は、前記期間±２４時間の３日目に添加される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記第２の期間は、３日間±２４時間である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記第３の期間は、１１日間±２４時間である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記第４の期間は、１０日間±２４時間である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記第５の期間は、２日間の期間±２４時間である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
ステップｅ）は、前記胃底部ｈＧＯをＢＭＰ４シグナル伝達の活性化因子と接触させるステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記機能的胃底部細胞タイプは、プロトンポンプタンパク質を発現し、かつ酸を分泌する傍細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記機能的胃底部細胞タイプは、ペプシノーゲンを分泌する主細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記ステップｅは、ＳＯＸ２＋ＧＡＴＡ＋ＰＤＸ１上皮を発達させるのに十分な期間実施される、請求項１に記載の方法。
（【請求項１１】以降は省略されています）
発明の詳細な説明【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１６年５月５日出願の米国仮特許出願第６２／３３２，１９４号に対する優先権及び利益を主張し、その内容がすべて参照により組み込まれる。
続きを表示（約 8,500 文字）【０００２】
政府支援条項
本発明は、Ａｌｌ１６４９１及びＤＫ０９２４５６の下での政府の支援を用いて行われた。当該政府は、本発明におけるある特定の権利を有する。
【背景技術】
【０００３】
胃疾患が地球規模で蔓延しているにもかかわらず、ヒトの胃の胃底部上皮を研究するための適切なモデルは少数である。ヒト胃底部型胃オルガノイド（ｈＦＧＯ）の開発は、ヒトの胃の生理学、病理生理学、及び薬剤開発の分子レベルの基礎を研究するための新規のかつ強力なモデルシステムであろう。
【発明の概要】
【０００４】
本開示は、哺乳類胚体内胚葉（ＤＥ）細胞を特定の組織（複数可）または器官（複数可）へと、定方向分化を通じて転換するための方法に関する。特に、本開示は、分化した胚体内胚葉から形成される胃底部組織及び／またはオルガノイドの形成に関する。
【図面の簡単な説明】
【０００５】
当業者は、以下に説明する図面が、単に説明目的のためにのみあることを理解するであろう。図面は、いかなる方法においても本教示の範囲を限定するよう企図するものではない。
【０００６】
Ｗｎｔ／βカテニンシグナル伝達は、マウスにおける胚性胃底部の特異性に必要である。ａ：Ｐｄｘ１及びＳｏｘ２を前庭（ａ）において発現させたのに対し、Ｐｄｘ１は、１８．５日胚でＡｔｐ４ｂ発現傍細胞によって識別されるように、胃底部（ｆ）に存在しなかった。ｂ：Ａｘｉｎ２：ＬａｃＺレポーター胚由来の１０．５日胚の前腸のＸ－ｇａｌ染色は、Ｗｎｔ活性が、胃の前部に制限されているが、後部胃からは除外されていることを示した。ｃ：胃上皮におけるβカテニンの欠失は、胃の胃底部領域へのＰｄｘ１の前部増殖を生じた。ｄ：１８．５日のＳｈｈ
Ｃｒｅ／＋
βカテニン
ｆｌ／ｆｌ
（ｃＫＯ）胚において、Ｐｄｘ１を胃のいたるところに発現させたが、例外は、壁細胞含有上皮のいくらかの残余のパッチにおいてであった。挿絵１ａ～１ｃ及び２ａ～２ｃはそれぞれ、対照の胃及びｃＫＯ胃における箱で囲まれた領域を示す。ｅ、ｃＫＯ胃において、Ｃｔｎｎｂ１は、モザイク状欠失を呈し、壁細胞は、Ｃｔｎｎｂ１の十分な上皮において分化しかしなかった。目盛尺：２５０μｍ（ａ）、２００μｍ（ｃ）、及び５００μｍ（ｄ及びｅ）。
βカテニンの活性化は、ヒト前腸前駆体スフェロイドからの胃底部の発達を促進する。ａ：胃底部及び前庭の両方のｈＧＯのための分化プロトコルの図式化した図。ｂ、ｃ：９日後に、ＣＨＩＲ処理したオルガノイドは、ＰＤＸ１の減少、ＩＲＸ２、ＩＲＸ３及びＩＲＸ５の増加、ならびに胃マーカーＳＯＸ２またはＧＡＴＡ４の変化がないことを呈した。＊：ｐ<０．０５、両側スチューデントｔ検定、ｎ＝３の生物学的複製物、データは４回の独立した実験を代表。ｄ：ｈＦＧＯは、ｈＡＧＯに匹敵して生育しただけでなく、腺出芽形態形成（白色の矢頭）も呈した。ｅ：両方のｈＧＯは、ＣＤＨ１、ＫＲＴ８、及びＣＴＮＮＢ１ならびに胃マーカーＧＡＴＡ４及びＣＬＤＮ１８を発現する上皮を含有していた。ｈＡＧＯは、ほぼ遍在的なＰＤＸ１発現を呈したのに対し、ｈＦＧＯは、呈しなかった。目盛尺：５０μｍ（ｃ）、５００μｍ（ｄ）及び１００μｍ（ｅ）。エラーバーは、平均値の標準誤差を表す。
ｈＧＯにおける粘膜及び内分泌細胞系譜の分化。ａ：胃の胃底部及び前庭の腺において認められた共有されかつ異なる系譜の模式図。ｂ：前庭及び胃底部のｈＧＯは両方とも、ＭＵＣ５ＡＣ陽性表面粘膜細胞及びＭＵＣ６陽性粘膜頸細胞を含有した。ｃ、ｄ：ｈＦＧＯは、傍内分泌マーカーＳＹＰを発現する内分泌細胞を含有した。異なるホルモン細胞タイプをｈＦＧＯにおいて識別し、これには、ＧＨＲＬ発現内分泌細胞、ＳＳＴ発現内分泌細胞、及びヒスタミン発現内分泌細胞を含んでいた。前庭特異的Ｇ細胞マーカーであるＧＡＳＴは、ｈＡＧＯでは発現したが、ｈＦＧＯでは発現せず、逆に、ＧＨＲＬは、ｈＦＧＯにおいて多量であった。＊＊：ｐ<０．０１、両側スチューデントｔ検定、ｈＡＧＯ及びｈＦＧＯにおいてそれぞれｎ＝８及び２４の生物学的複製物、データは６回の独立した実験を代表。ｅ：ｈＡＧＯは、プロ内分泌転写因子ＮＥＵＲＯＧ３（＋ｄｏｘ）の発現に応じて、前庭特異的ＧＡＳＴ発現内分泌細胞を生じる能力があったが、ｈＦＧＯはそうではなかった。＊：ｐ<０．０１、両側スチューデントｔ検定、ｎ＝４の生物学的複製物、データは３回の独立した実験を代表。エラーバーは、平均値の標準誤差を表す。
ｈＦＧＯにおける主細胞の形成。ａ：ｈＦＧＯは、ＭＩＳＴ１及びペプシノーゲンＣ（ＰＧＣ）の両方に陽性の細胞を有していた。ｂ：尖端のＰＧＣ染色を有する一群の細胞を有する腺を示すパネル（ａ）における箱で囲まれた領域の高解像度。ｃ：ｈＦＧＯは、ｈＡＧＯと比較して、主細胞マーカーＰＧＡ５（１０００倍）、ＰＧＣ（１００倍）、及びＭＩＳＴ１（１０倍超）の有意に高い発現を有していた。＊＊：ｐ<０．０５、両側スチューデントｔ検定。ｎ＝３の生物学的複製物、データは４回の独立した実験を代表。ｄ：主細胞を示す密なチモーゲン果粒を含有するｈＦＧＯ細胞の透過電子顕微鏡写真。ｅ：ＭＥＫ阻害因子（ＰＤ０３）の有無の下でのｈＡＧＯと比較したｈＦＧＯのペプシノーゲンタンパク質含有量。＊＊：ｈＡＧＯと比較してｐ<０．０００１、両側スチューデントｔ検定、ｈＡＧＯ、対照ｈＦＧＯ及びｈＦＧＯ（ＰＤ０３非含有）においてそれぞれ、ｎ＝８、１２、及び１１の生物学的複製物。目盛尺：２００μｍ（ａ）、２５μｍ（ｂ）、及び１０μｍ（ｄ）。エラーバーは、平均値の標準誤差を表す。
ｈＦＧＯにおける機能的傍細胞の分化を駆動する経路の識別。ａ：傍細胞遺伝子ＡＴＰ４、ＡＴＰ４Ｂ、及びＧＩＦの発現は、ベースラインで卵胞と比較して、ｈＦＧＯの１０～１００倍の増加を呈したが、ＰＤ０３／ＢＭＰ４の２日間のパルスへｈＦＧＯを曝露することによって劇的に亢進した。＊＊：ｈＡＧＯと比較してｐ<０．０５、＃：対照ｈＦＧＯと比較してｐ<０．０５、両側スチューデントｔ検定、ｎ＝４の生物学的複製物、データは１５回の独立した実験を代表。ｂ：ＰＤ０３／ＢＭＰ４を用いた処理後のＡＴＰ４Ｂ発現傍細胞の刺激された分化。ｃ：ｈＦＧＯ由来の傍細胞は、インビボでの成熟マウス胃底部上皮において認められる傍細胞と類似していた。ｄ：傍細胞を想起させる小管構造を有するｈＦＧＯ細胞の透過型電子顕微鏡写真。ｅ：ヒト胃底部腺の上皮及びｈＦＧＯ上皮を、表面上皮におけるＭＵＣ５ＡＣ発現細胞、及び腺性単位におけるＡＴＰ４Ｂ発現傍細胞へと組織化した。ｆ；ＳＮＡＲＦ－５Ｆの管腔注射によるヒスタミンに応じたオルガノイドにおける管腔ｐＨの分析。ｈＦＧＯにおける管腔ｐＨは迅速に低下したのに対し、ｈＡＧＯは応答を呈しなかった。オルガノイドをファモチジンまたはオメプラゾールのいずれかで前処理することによって、酸性化を遮断した。ｈＦＧＯ（ヒスタミン）、ｈＦＧＯ（ヒスタミン及びファモチジン）、ｈＦＧＯ（ヒスタミン及びオメプラゾール）、及びｈＡＧＯ（ヒスタミン）のそれぞれにおけるｎ＝９、９、７、及び４の生物学的複製物、データは３回の独立した実験を代表。ｇ：単離したマウス胃腺及びｈＦＧＯにおける小管型パターンでのヒスタミン誘導性アクリジンオレンジ（ＡＯ）色素の６０分後の蓄積。目盛尺：１００μｍ（ｂ）、１０μｍ（ｃ）、１０μｍ（ｄ）、１００μｍ（ｅ；ヒト胃底部）、２０μｍ（ｅ；ｈＦＧＯ）、及び１０μｍ（ｇ）。エラーバーは、平均値の標準誤差を表す。
インビボで発達中の胃において規定中の分子ドメイン。ａ：マウス胚の胃（１４．５日胚）におけるＳｏｘ２、Ｐｄｘ１、及びＧａｔａ４の分析は、胃底部（ｆ）がＳｏｘ２＋Ｇａｔａ４＋Ｐｄｘ１－であるのに対し、前庭（ａ）がＳｏｘ２＋Ｇａｔａ４＋Ｐｄｘ１＋であることを示した。前胃（ｆｓ）は、Ｓｏｘ２を発現したが、Ｇａｔａ４もＰｄｘ１も発現しなかった。ｂ：定量的ＰＣＲによって分析した１４．５日胚のマウス胃の摘出した領域を示す明視野立体顕微鏡写真。ｆｓ：前胃、ｆ：胃底部、ａ；前庭、ｄ：十二指腸、ｃ：ｂにおける摘出された領域を、既知の局所的に発現したマーカー（Ｓｏｘ２、Ｐ６３、Ｇａｔａ４、Ｐｄｘ１、及びＣｄｘ２）についての定量的ＰＣＲによって分析して、微量摘出の正確性を確証した。摘出した１４．５日胚の胃の領域の定量的ＰＣＲ分析は、推定上の胃底部マーカーＩｒｘ１、Ｉｒｘ２、Ｉｒｘ３、Ｉｒｘ５、及びＰｉｔｘ１は、前庭と比較して胃底部において豊富であることを示した。１箇所の摘出領域当たりのｎ＝４の生物学的複製物。目盛尺：５００μｍ。エラーバーは、標準偏差を表す。
βカテニンｃＫＯ胚の分析。ａ：１２．４日胚及び１４．５日胚までに、異所性Ｐｄｘ１発現をｃＫＯ胚の背側胃上皮のいたるところ及び最も近位の胃上皮で観察した。ｂ：１４．５日胚のｃＫＯ前腸の摘出した領域の定量的ＰＣＲ分析（図６のｂ）は、胃底部及び前胃部におけるＰｄｘ１の有意な上方調節を示した。逆に、Ｉｒｘ２、Ｉｒｘ３、及びＩｒｘ５は、これらの近位の領域において顕著に減少した。＊：ｐ<０．０５、両側スチューデントｔ検定、各遺伝子型について摘出した領域につきｎ＝３の生物学的複製物。ｃ：１８．５日胚から摘出した内臓の立体顕微鏡写真は、ｃＫＯ胚が既に報告した通り肺の非形成を呈することを実証した。消化管、特に胃は、大きさが劇的に減少した。ｄ：１８．５日胚での免疫蛍光染色は、Ｃｔｎｎｂ１のモザイク欠失パターンを明らかにした。箱で囲まれた領域を図１に示す。ｅ：１８．５日胚のｃＫＯ胃において、Ｃｔｎｎｂ１染色を欠失する組換え腺は、傍細胞を含有していなかったのに対し、頑強な傍細胞の分化は、Ｃｔｎｎｂ１陽性腺において観察された。目盛尺：２００μｍ（ａ）、５００μｍ（ｄ）、及び５０μｍ（ｅ）。エラーバーは、標準偏差を表す。
ｈＧＯにおける胃底部の運命の適切な誘導及びプロトコルの効率。ａ：発明者は、ＣＨＩＲ処理が胃底部の識別を確立するのにどれだけ長く必要であるかを研究した。３４日後までの対照成長培地中でのオルガノイドの簡潔なＣＨＩＲ処理（６～９日間）及びその後の成長は結果的に、前庭マーカーＰＤＸ１を発現する胃底部オルガノイドを生じ、短期間のＣＨＩＲ処理が胃底部の運命を安定させないことを示唆した。次に、発明者は、ＣＨＩＲへのより長い曝露が胃底部の運命を保持するのに必要であるかどうかを検査し、少なくとも２９日後までの連続的な処理のみが前庭マーカーＰＤＸ１の少量の発現を維持することができることを発見した。＊：対照前庭ｈＧＯと比較してｐ<０．０５、両側スチューデントｔ検定。ｎ＝３の生物学的複製物、データは２回の独立した実験を代表。ｂ、ｃ：プロトコルの経過にわたって、ＰＤＸ１は、ＣＨＩＲ処理したオルガノイドにおいて低いままであったのに対し、ＩＲＸ５発現は、持続的に上昇した。＊：ｐ<０．０５、両側スチューデントｔ検定、時点あたりｎ＝３の生物学的複製物。ｄ：６日胚の後部前腸スフェロイドから初期胃オルガノイド（２０日胚）への転換は、ｈＡＧＯプロトコル及びｈＦＧＯプロトコルの両方において８０％超ほど効率的である。ｅ：２０日胚で、ｈＦＧＯ上皮は、約９０％のＧＡＴＡ４＋／ＳＯＸ２＋／ＰＤＸ１－であるのに対し、ｈＡＧＯ上皮は、約９０％のＧＡＴＡ４＋／ＳＯＸ２＋／ＰＤＸ１＋である。＊＊：ｐ<０．００１、両側スチューデントｔ検定、実験あたりｎ＝４の生物学的複製物であって、２回の独立した実験が示されている。目盛尺：１００μｍ（ｃ）及び２００μｍ（ｄ）。
前腸前駆体から小腸の運命を誘導するためのＷｎｔ／βカテニン活性化のＢＭＰ依存性。ａ：小腸特異的転写因子ＣＤＸ２は、９日後も２０日後もＣＨＩＲ処理したｈＧＯにおいて有意に誘導されなかった。ｂ：ヒト小腸オルガノイド（ｈＩＯ）と比較した場合、胃底部ｈＧＯも前庭ｈＧＯも、ＭＵＣ２、ＣＣＫ、及びＳＣＴを含む、小腸細胞タイプと関連した遺伝子を発現しなかった。＊：ｈＩＯと比較してｐ<０．０５、両側スチューデントｔ検定。ｎ＝３の生物学的複製物。ｃ：前後の運命は、ＷＮＴ及びＢＭＰの活性によって協調して制御されている。ＢＭＰ阻害因子ノギンの存在下で、Ｗｎｔ／βカテニン経路活性にもかかわらず、オルガノイドはすべて、前腸を維持した（ＳＯＸ２＋）が、ＢＭＰ４の存在下では、オルガノイドはすべて、後側化した（ＣＤＸ２＋）。ＢＭＰ阻害状態におけるＷｎｔ（ＣＨＩＲ）の活性化は結果的に、胃底部パターンを生じた（ＳＯＸ２＋、ＰＤＸ１－、ＣＤＸ２－）のに対し、ＷＮＴ（ＣＨＩＲ）の活性化及びＢＭＰ４の添加は結果的に、小腸の運命を生じた（ＣＤＸ２＋）。＊：類似のノギン処理条件と比較してｐ<０．０５、両側スチューデントｔ検定。ｎ＝３の生物学的複製物。ｄ：ヒト組織の免疫蛍光染色は、ＣＬＤＮ１８が小腸では認められない胃特異的上皮マーカーであることを明らかにした。目盛尺：２００μｍ。エラーバーは、平均値の標準誤差を表す。
ｈＦＧＯは、関連する間充織層によって支持される組織化した腺を含有する。ａ：透過電子顕微鏡写真は、ｈＦＧＯ腺が、狭小尖端膜とともに組織化した構造を呈することを実証した。ｂ：ｈＦＧＯ及びｈＡＧＯの両方は、支持層であるＦＯＸＦ１＋／ＶＩＭ＋未分化線維芽細胞を含有していた。目盛尺：５μｍ（ａ）及び１００μｍ（ｂ）。
ヒト胃オルガノイドにおける局所特異的細胞分化。ａ：前庭及び胃底部ｈＧＯは、粘膜細胞マーカーＭＵＣ５ＡＣ及びＭＵＣ６のかなりの発現を呈した。ｂ：透過電子顕微鏡写真において示されるように、ｈＦＧＯは、分化した主細胞への前駆体である粘膜頸細胞と一致した果粒パターンを呈する多量の細胞を含有していた。ｃ：ＮＥＵＲＯＧ３欠乏性ｈＥＳＣ株に由来するｈＧＯにおけるＮＥＵＲＯＧ３の外来性発現は、ＳＹＰ陽性内分泌細胞の頑強な分化を誘導した。ｈＡＧＯ及びｈＦＧＯの両方が、ＧＨＲＬ発現内分泌細胞及びＳＳＴ発現内分泌細胞を形成したが、ＧＡＳＴ＋Ｇ細胞の特異性は、ｈＡＧＯにおいてのみ観察された。ｄ：ｈＧＯ及びヒト胃生検組織における細胞系譜マーカーの発現比較。定量的ＰＣＲ分析は、ｈＧＯがいくつかの系譜マーカー（ＭＵＣ５ＡＣ、ＡＴＰ４Ｂ）のかなりの発現レベルを呈する一方で、他の遺伝子が、完全に分化した成体ヒト胃において認められるよりも非常に低レベルで発現する（ＡＴＰ４Ａ、ＰＧＡ５、及びＰＧＣ）ことを実証した。目盛尺：５μｍ（ｂ）及び１００μｍ（ｃ）。エラーバーは、標準偏差（ａ）及び平均値の標準誤差（ｂ）を表す。
マウス主細胞発生の分析。ａ：後期胚期と同じくらい早く機能的マーカー（Ａｔｐ４ｂ）を発現する傍細胞とは異なり、主細胞遺伝子産物は、発生のかなり後期まで検出することはできなかった。胚（１８．５日胚）及び若齢個体（Ｐ１２）の胃において、Ｇｉｆ及びＰｇｃは、まだ発現しておらず、主細胞が、胃上皮における他の系譜よりも発生上非常に遅く成熟することを示した。ｂ：Ｐｇｃがないにもかかわらず、Ｐ１２マウスの胃は、主細胞特異的マーカーである核ＭｉＳＴ１を発現する多量の腺細胞を含有していた。したがって、主細胞は、実際により早期に特異化するが、終末分化マーカーの頑強な発現を発生させるために数週間かかった。目盛尺：１００μｍ（ａ）及び２００μｍ（ｂ）。
胃底部ｈＧＯにおける傍細胞の分化を促進する経路のためのスクリーニング。ａ：傍細胞の分化を誘導することのできる成長因子／小分子について検査するために、示されたアゴニストまたはアンタゴニストへｈＦＧＯを２日間（３０～３２）曝露した後、３４日後に分析した。異なる経路のスクリーニング実験において、ＰＤ０３を用いたＭＥＫ阻害のみが、ＡＴＰ４Ａ／Ｂの発現を頑強に誘導することが発見された。ｂ：培地からのＥＧＦの減少または除去は、ＭＥＫ阻害の効果を再現するのに十分ではなかった。ｃ：傍細胞発生を誘導するＰＤ０３／ＢＭＰ４の能力は、前庭ｈＧＯがＰＤ０３／ＢＭＰ４に応じて胃底部マーカーを発現しなかったので、胃底部ｈＧＯに限定されていた。ｄ：ＰＤ０３／ＢＭＰ４への曝露は、胃底部ｈＧＯにおけるＡＴＰ４Ａ及びＡＴＰ４Ｂの発現を迅速に高めた。ｅ：ＰＤ０３／ＢＭＰ４を用いた傍細胞発生の誘導は、主細胞（ＰＧＡ５及びＰＧＣ）及び内分泌細胞（ＣＨＧＡ）の分化に有意に影響しなかった。ｆ：ｈＦＧＯ分化プロトコルの各期における操作は、いかなる単一のステップの除去もＡＴＰ４Ａ／Ｂ発現の喪失をもたらしたので、頑強な傍細胞分化に必要であった。エラーバーは、標準偏差（ａ～ｃ）及び平均値の標準誤差（ｄ～ｆ）を表す。
胃オルガノイドにおける生でのインビトロｐＨモニタリング。ａ：色素ＳＮＡＦＲ５Ｆは、５～８のｐＨ範囲にわたって応答性を呈し、このことは、傍細胞仲介性酸分泌に応じた生理学的変化を検出するのに十分適していた。ｂ：ヒスタミン添加の前（黒丸）及び６０分後（白丸）に記録した培地及び管腔のｐＨ測定。前庭ｈＧＯは、ヒスタミンに対して応答しなかったのに対し、胃底部ｈＧＯは、ヒスタミンに応答して管腔ｐＨを低下させた。ファモチジンまたはオメプラゾールのいずれかを用いたオルガノイドの前処理によって、酸性化を阻害した。さらに、オメプラゾールは、ヒスタミン曝露の前に胃底部オルガノイドのｐＨを上昇させるのに十分であり、このことは、胃底部オルガノイドにおけるベースラインの酸分泌を示唆していた。培地のｐＨは、いかなるオルガノイドも変化させなかった。＊＊＊：ヒスタミン前と比較してｐ<０．００１、＄＄＄：ヒスタミンなしでの管腔ｐＨと比較してｐ<０．００１、＃＃＃：ヒスタミンありでの管腔ｐＨと比較してｐ<０．００１、両側スチューデントｔ検定。ｃ：ｈＦＧＯは、腺の管腔を裏打ちする細胞のほぼすべてにおいてアクリジンオレンジ（ＡＯ）が蓄積した傍細胞の密な腺を含有していた。ｄ：ＡＯ蓄積は、ｈＦＧＯの傍細胞における小管型パターンで観察された。目盛尺：１０μｍ。エラーバーは、標準偏差を表す。
ヒト胃オルガノイドの連続継代。ａ：ｈＧＯにおける胃幹細胞の存在を判定するための実験の概略図。ｂ：ＥＧＦのみを含有する培地中で断片を生育させたとき、新たなオルガノイドを形成するよう生育も増殖もしなかった。しかしながら、培地へのＣＨＩＲ及びＦＧＦ１０の添加は、新たに形成されたオルガノイドへの個々の断片の生育を支持するのに十分であった。ｃ：２回の継代後、ｈＦＧＯは、ＰＧＣ、ＭＵＣ６、ＭＵＣ５ＡＣ、及びＧＨＲＬを含む、胃表現型と一致する遺伝子をなおも発現した。胃の同一性を維持しながら連続継代を受けるこの能力は、ｈＦＧＯが、成体胃幹細胞と類似の特性を有する細胞を含有するという結論を支持している。ｄ：継代したｈＦＧＯは、いくつかの分化した胃細胞タイプと関係するマーカーを発現したが、ＡＴＰ４Ｂなどの傍細胞と関係する遺伝子を発現しなかった。さらに、傍細胞の分化は、継代前ではＭＥＫ阻害を通じて誘導することができたのに、ＭＥＫ阻害を通じて誘導することはできなかった。エラーバーは、標準偏差を表す。
【発明を実施するための形態】
【０００７】
別段の記載がない限り、用語は、当業者による従来の使用により理解されるものとする。
【０００８】
本明細書で使用する場合、「胃底部組織」という用語は、酸産生傍細胞及びプロテアーゼ産生主細胞を含むがこれらに限定されない胃底部細胞タイプを含有する体において認められる胃上皮の胃底部タイプを意味する。
【０００９】
本明細書で使用する場合、「胚体内胚葉（ＤＥ）細胞」という用語は、原腸形成の過程によって生じる３つの主要な胚葉のうちの１つを意味する。
【００１０】
本明細書で使用する場合、「ｗｎｔシグナル伝達経路」という用語は、ｗｎｔ／ベータカテニン経路を意味しており、ベータカテニンタンパク質を通じて作用する、Ｗｎｔリガンドと縮れた（ｆｒｉｚｚｌｅｄ）細胞表面の受容体とによって仲介されるシグナル伝達経路である。
（【００１１】以降は省略されています）

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