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公開番号2024079909
公報種別公開特許公報(A)
公開日2024-06-13
出願番号2022192595
出願日2022-12-01
発明の名称高増殖性細胞、その製造方法、およびその用途
出願人学校法人東京医科大学
代理人個人
主分類C12N 5/071 20100101AFI20240606BHJP(生化学;ビール;酒精;ぶどう酒;酢;微生物学;酵素学;突然変異または遺伝子工学)
要約【課題】細胞増殖能が高められた高増殖性細胞およびその製造方法を提供すること。
【解決手段】外胚葉性細胞の特徴を備え、以下のA1の発現挙動を示す、外胚葉性細胞由来の高増殖性細胞。(A1)前記高増殖性細胞において、GFAP、S100B、Musashi1、CSPG4、Nestin、およびSLC1A3からなる群から選択された少なくとも1つのマーカー遺伝子の発現量(E₁)およびコントロール遺伝子の発現量(E_C)によって決定される相対値(E₁/E_C)が、特定の基準範囲を充たす。
【選択図】なし
特許請求の範囲【請求項１】
外胚葉性細胞の特徴を備え、以下のＡ１の発現挙動を示す、外胚葉性細胞由来の高増殖性細胞。
（Ａ１）前記高増殖性細胞において、ＧＦＡＰ、Ｓ１００Ｂ、Ｍｕｓａｓｈｉ１、ＣＳＰＧ４、Ｎｅｓｔｉｎ、およびＳＬＣ１Ａ３からなる群から選択された少なくとも１つのマーカー遺伝子の発現量（Ｅ
１
）およびコントロール遺伝子の発現量（Ｅ
Ｃ
）によって決定される相対値（Ｅ
１
／Ｅ
Ｃ
）が、下記表１で表される基準範囲を充たす。
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続きを表示（約 1,600 文字）【請求項２】
外胚葉性細胞の特徴を備え、外胚葉性細胞を低分子シグナル伝達経路阻害剤と接触させた２８日以下の培養期間後の細胞数が、前記阻害剤と非接触である以外は同一の培養条件で同一の培養期間にわたり培養された外胚葉性細胞の細胞数に対して、１．０倍を超える増殖能を有する、高増殖性細胞。
【請求項３】
前記高増殖性細胞が、ＧＦＡＰ、ＳＯＸ２、Ｍｕｓａｓｈｉ１、およびＮｅｓｔｉｎから選択される少なくとも１つのマーカー遺伝子の発現量が、低分子シグナル伝達経路阻害剤と非接触である以外は同一の培養条件で同一の培養期間にわたり培養された外胚葉性細胞の１．０倍以上である細胞を含む、請求項１または２に記載の高増殖性細胞。
【請求項４】
前記高増殖性細胞が、外胚葉性前駆細胞を含む、請求項１～３のいずれか１項に記載の高増殖性細胞。
【請求項５】
前記外胚葉性細胞が、アストロサイトを含む、請求項１～４のいずれか１項に記載の高増殖性細胞。
【請求項６】
高増殖性細胞の製造方法であって、
（ｉ）原料となる外胚葉性細胞を用意すること、
（ｉｉ）低分子シグナル伝達経路阻害剤の存在下、前記原料となる外胚葉性細胞を培養することにより、前記原料となる外胚葉性細胞よりも細胞増殖能が高められた高増殖性細胞を得ること
を含み、
前記（ｉｉ）において、前記阻害剤の存在下での培養期間が、２８日以下である、高増殖性細胞の製造方法。
【請求項７】
高増殖性細胞の製造方法であって、
（ｉ）原料となる外胚葉性細胞を用意すること、
（ｉｉ）低分子シグナル伝達経路阻害剤の存在下、前記原料となる外胚葉性細胞を培養することにより、前記原料となる外胚葉性細胞よりも細胞増殖能が高められた高増殖性細胞を得ること
を含み、
前記（ｉｉ）において、条件ａ１、条件ｂ１および条件ｃ１からなる群より選択される少なくとも１つを充たすまで、前記阻害剤の存在下での培養を行う、高増殖性細胞の製造方法。
（ａ１）前記阻害剤の存在下で培養している細胞において、ＧＦＡＰ、Ｓ１００Ｂ、Ｍｕｓａｓｈｉ１、ＣＳＰＧ４、Ｎｅｓｔｉｎ、およびＳＬＣ１Ａ３からなる群から選択された少なくとも１つのマーカー遺伝子の発現量（Ｅ
１
）およびコントロール遺伝子の発現量（Ｅ
Ｃ
）によって決定される相対値（Ｅ
１
／Ｅ
Ｃ
）が、下記表２で表される基準範囲を充たす。
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（ｂ１）前記阻害剤の存在下で培養している細胞の細胞数が、前記阻害剤の非存在下である以外は同一の培養条件で同一の培養期間にわたり培養された外胚葉性細胞の細胞数に対して、１．０倍を超える。
（ｃ１）前記阻害剤の存在下で培養している細胞において、ＧＦＡＰ、ＳＯＸ２、Ｍｕｓａｓｈｉ１、およびＮｅｓｔｉｎから選択される少なくとも１つのマーカー遺伝子の発現量が、前記阻害剤の非存在下である以外は同一の培養条件で同一の培養期間にわたり培養された外胚葉性細胞の１．０倍以上である。
【請求項８】
前記原料となる外胚葉性細胞が、中枢神経系の細胞を含む、請求項６または７に記載の高増殖性細胞の製造方法。
【請求項９】
前記原料となる外胚葉性細胞が、アストロサイトを含む、請求項６～８のいずれか１項に記載の高増殖性細胞の製造方法。
【請求項１０】
前記阻害剤が、ＴＧＦβ受容体阻害剤およびＲＯＣＫ阻害剤からなる群より選択される少なくとも１つの化合物を含む、請求項６～９のいずれか１項に記載の高増殖性細胞の製造方法。
（【請求項１１】以降は省略されています）
発明の詳細な説明【技術分野】
【０００１】
本発明は、高増殖性細胞、その製造方法、およびその用途に関する。
続きを表示（約 3,400 文字）【背景技術】
【０００２】
再生医療の分野において、生体内の種々の細胞、種々の分化段階の細胞、または特定方向へ分化誘導された細胞等が利用されている。生体での使用を考慮すれば、これらの細胞については、遺伝子改変を伴わないことが望ましい。これまで、内胚葉性の成熟細胞に特定の低分子化合物を接触させることにより、遺伝子改変を伴うことなく、前記成熟細胞を、幹細胞または前駆細胞にリプログラミングできることが報告されている（特許文献１および特許文献２）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
国際公開第２０１７／１１９５１２号
国際公開第２０２０／０８０５５０号
【発明の概要】
【０００４】
一方、遺伝子改変を行わずに得られる細胞、なかでも比較的、成熟細胞に近い細胞の多くは、増殖能に制限があって、長期にわたって生体内外で維持できない傾向がある。このため、細胞の機能の長期利用、または、細胞が生成する有用物質の大量生産等に有効な高増殖性の細胞に対する要請が、依然として残されている。特に、神経系の細胞を含む外胚葉性細胞については、内胚葉性細胞と異なり十分に利用できていない。
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本開示の目的は、高増殖性細胞、高増殖性細胞を製造する方法、およびその用途を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、鋭意研究を行った結果、特定の性質を有する外胚葉性細胞由来の高増殖性細胞を得た。
【０００７】
すなわち、本開示は以下の形態を含む。
［１］外胚葉性細胞の特徴を備え、以下のＡ１の発現挙動を示す、外胚葉性細胞由来の高増殖性細胞。
（Ａ１）前記高増殖性細胞において、ＧＦＡＰ、Ｓ１００Ｂ、Ｍｕｓａｓｈｉ１、ＣＳＰＧ４、Ｎｅｓｔｉｎ、およびＳＬＣ１Ａ３からなる群から選択された少なくとも１つのマーカー遺伝子の発現量（Ｅ
１
）およびコントロール遺伝子の発現量（Ｅ
Ｃ
）によって決定される相対値（Ｅ
１
／Ｅ
Ｃ
）が、下記表１で表される基準範囲を充たす。
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2024079909000001.tif
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［２］外胚葉性細胞の特徴を備え、外胚葉性細胞を低分子シグナル伝達経路阻害剤と接触させた２８日以下の培養期間後の細胞数が、前記阻害剤と非接触である以外は同一の培養条件で同一の培養期間にわたり培養された外胚葉性細胞の細胞数に対して、１．０倍を超える増殖能を有する、高増殖性細胞。
［３］前記高増殖性細胞が、ＧＦＡＰ、ＳＯＸ２、Ｍｕｓａｓｈｉ１、およびＮｅｓｔｉｎから選択される少なくとも１つのマーカー遺伝子の発現量が、低分子シグナル伝達経路阻害剤と非接触である以外は同一の培養条件で同一の培養期間にわたり培養された外胚葉性細胞の１．０倍以上である細胞を含む、［１］または［２］に記載の高増殖性細胞。
［４］前記高増殖性細胞が、外胚葉性前駆細胞を含む、［１］～［３］のいずれか１項に記載の高増殖性細胞。
［５］前記外胚葉性細胞が、アストロサイトを含む、［１］～［４］のいずれか１項に記載の高増殖性細胞。
【０００８】
［６］高増殖性細胞の製造方法であって、
（ｉ）原料となる外胚葉性細胞を用意すること、
（ｉｉ）低分子シグナル伝達経路阻害剤の存在下、前記原料となる外胚葉性細胞を培養することにより、前記原料となる外胚葉性細胞よりも細胞増殖能が高められた高増殖性細胞を得ること
を含み、
前記（ｉｉ）において、前記阻害剤の存在下での培養期間が、２８日以下である、高増殖性細胞の製造方法。
［７］高増殖性細胞の製造方法であって、
（ｉ）原料となる外胚葉性細胞を用意すること、
（ｉｉ）低分子シグナル伝達経路阻害剤の存在下、前記原料となる外胚葉性細胞を培養することにより、前記原料となる外胚葉性細胞よりも細胞増殖能が高められた高増殖性細胞を得ること
を含み、
前記（ｉｉ）において、条件ａ１、条件ｂ１および条件ｃ１からなる群より選択される少なくとも１つを充たすまで、前記阻害剤の存在下での培養を行う、高増殖性細胞の製造方法。
（ａ１）前記阻害剤の存在下で培養している細胞において、ＧＦＡＰ、Ｓ１００Ｂ、Ｍｕｓａｓｈｉ１、ＣＳＰＧ４、Ｎｅｓｔｉｎ、およびＳＬＣ１Ａ３からなる群から選択された少なくとも１つのマーカー遺伝子の発現量（Ｅ
１
）およびコントロール遺伝子の発現量（Ｅ
Ｃ
）によって決定される相対値（Ｅ
１
／Ｅ
Ｃ
）が、下記表２で表される基準範囲を充たす。
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（ｂ１）前記阻害剤の存在下で培養している細胞の細胞数が、前記阻害剤の非存在下である以外は同一の培養条件で同一の培養期間にわたり培養された外胚葉性細胞の細胞数に対して、１．０倍を超える。
（ｃ１）前記阻害剤の存在下で培養している細胞において、ＧＦＡＰ、ＳＯＸ２、Ｍｕｓａｓｈｉ１、およびＮｅｓｔｉｎから選択される少なくとも１つのマーカー遺伝子の発現量が、前記阻害剤の非存在下である以外は同一の培養条件で同一の培養期間にわたり培養された外胚葉性細胞の１．０倍以上である。
［８］前記原料となる外胚葉性細胞が、中枢神経系の細胞を含む、［６］または［７］に記載の高増殖性細胞の製造方法。
［９］前記原料となる外胚葉性細胞が、アストロサイトを含む、［６］～［８］のいずれか１項に記載の高増殖性細胞の製造方法。
［１０］前記阻害剤が、ＴＧＦβ受容体阻害剤およびＲＯＣＫ阻害剤からなる群より選択される少なくとも１つの化合物を含む、［６］～［９］のいずれか１項に記載の高増殖性細胞の製造方法。
［１１］前記（ｉｉ）において、前記阻害剤の存在下での培養が、前記阻害剤を含む培地を用いた培養であり、前記培地における前記阻害剤の濃度が、０．００１μＭ～１００μＭの範囲内である、［６］～［１０］のいずれか１項に記載の高増殖性細胞の製造方法。
【０００９】
［１２］（Ｉ）［１］～［５］のいずれか１項に記載の外胚葉性細胞由来の高増殖性細胞の培養物を得ること、または、［６］～［１１］のいずれか１項に記載の製造方法を実施して高増殖性細胞の培養物を得ること、および
（ＩＩ）前記培養物から、前記高増殖性細胞から分泌された細胞分泌物を分離すること
を含む、高増殖性細胞由来の細胞分泌物の製造方法。
［１３］前記細胞分泌物が、エクソソームを含む、請求項１２に記載の細胞分泌物の製造方法。
【００１０】
［１４］タンパク質およびｍｉＲＮＡの少なくとも一方を含む細胞分泌物であって、
前記タンパク質は、
糖タンパク質Ｍ６Ｂ（Ｑ１３４９１）、ＨＬＡクラスＩＩ組織適合抗原、ＤＲα鎖（Ｐ０１９０３）、トゥイーティーホモログ１（Ｑ９Ｈ３１３）、フィブリリン－２（Ｐ３５５５６）、ＨＬＡクラスＩＩ組織適合抗原、ＤＲＢ１β鎖（Ｐ０１９１１）、およびＳ１００カルシウム結合タンパク質Ａ８（Ｐ０５１０９）の組み合わせを含み、
前記ｍｉＲＮＡは、
ｈｓａ－ｍｉＲ－２０６（ＭＩＭＡＴ００００４６２）、ｈｓａ－ｍｉＲ－２０４－５ｐ（ＭＩＭＡＴ００００２６５）、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２８－３ｐ（ＭＩＭＡＴ００００４２４）、ｈｓａ－ｍｉＲ－３６３－３ｐ（ＭＩＭＡＴ００００７０７）、およびｈｓａ－ｍｉＲ－３２３ａ－３ｐ（ＭＩＭＡＴ００００７５５）の組み合わせを含む、細胞分泌物。
【発明の効果】
（【００１１】以降は省略されています）

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