特許ウォッチ

公開番号2024044062
公報種別公開特許公報(A)
公開日2024-04-02
出願番号2022149382
出願日2022-09-20
発明の名称リパーゼ変異体
出願人花王株式会社
代理人弁理士法人アルガ特許事務所
主分類C12N 15/55 20060101AFI20240326BHJP(生化学;ビール;酒精;ぶどう酒;酢;微生物学;酵素学;突然変異または遺伝子工学)
要約【課題】異種発現性が向上したリパーゼ変異体の提供。
【解決手段】親リパーゼのアミノ酸配列に対して、ある特定のアミノ酸配列を基準とした番号付けでの所定位置におけるアミノ酸残基が所定のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列からなる、リパーゼ変異体。前記親リパーゼは、Proteus属細菌やYersinia属細菌に由来するリパーゼを含む同一のクレード(Proteus/Yersiniaクレード)に属するリパーゼであってよい。
【選択図】なし
特許請求の範囲【請求項１】
下記（ａ）～（ｖ）から選択されるいずれかのリパーゼ変異体：
（ａ）配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも８２％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の１１８位に相当する位置にアスパラギン酸を有するリパーゼ変異体；
（ｂ）配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の３１位に相当する位置にチロシンを有するリパーゼ変異体；
（ｃ）配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも９１％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の３２位に相当する位置にグリシンを有するリパーゼ変異体；
（ｄ）配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の９０位に相当する位置にシステインを有するリパーゼ変異体；
（ｅ）配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも９４％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の１８１位に相当する位置にロイシンを有するリパーゼ変異体；
（ｆ）配列番号６のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の２２２位に相当する位置にアラニン、スレオニン、ヒスチジン又はグリシンを有するリパーゼ変異体；
（ｇ）配列番号８のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の３９位に相当する位置にリジンを有するリパーゼ変異体；
（ｈ）配列番号８のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の１２５位に相当する位置にスレオニンを有するリパーゼ変異体；
（ｉ）配列番号８のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の１２６位に相当する位置にプロリンを有するリパーゼ変異体；
（ｊ）配列番号８のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の２９３位に相当する位置にグリシンを有するリパーゼ変異体；
（ｋ）配列番号１０のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の２９位に相当する位置にチロシンを有するリパーゼ変異体；
（ｌ）配列番号１０のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の３１位に相当する位置にチロシンを有するリパーゼ変異体；
（ｍ）配列番号１０のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の３２位に相当する位置にグリシンを有するリパーゼ変異体；
（ｎ）配列番号１０のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の１８６位に相当する位置にグリシンを有するリパーゼ変異体；
（ｏ）配列番号１２のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の２０６位に相当する位置にグルタミンを有するリパーゼ変異体；
（ｐ）配列番号１４のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の３１位に相当する位置にチロシンを有するリパーゼ変異体；
（ｑ）配列番号１４のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の３２位に相当する位置にグリシンを有するリパーゼ変異体；
（ｒ）配列番号１４のアミノ酸配列と少なくとも９７％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の７７位に相当する位置にリジンを有するリパーゼ変異体；
（ｓ）配列番号１４のアミノ酸配列と少なくとも８３％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の１８１位に相当する位置にロイシンを有するリパーゼ変異体；
（ｔ）配列番号１６のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の９０位に相当する位置にシステインを有するリパーゼ変異体；
（ｕ）配列番号１６のアミノ酸配列と少なくとも８１％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の１８１位に相当する位置にロイシンを有するリパーゼ変異体；
（ｖ）配列番号３４のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の２９位に相当する位置にチロシンを有するリパーゼ変異体。
続きを表示（約 3,500 文字）【請求項２】
下記（ａａ）～（ａｅ）から選択されるいずれかのリパーゼ変異体：
（ａａ）配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の３１位に相当する位置におけるチロシン、３２位に相当する位置におけるグリシン、９０位に相当する位置におけるシステイン、及び１８１位に相当する位置におけるロイシンから選ばれる少なくとも２つのアミノ酸残基を有するリパーゼ変異体；
（ａｂ）配列番号８のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の３９位に相当する位置におけるリジン、１２５位に相当する位置におけるスレオニン、１２６位に相当する位置におけるプロリン、及び２９３位に相当する位置におけるグリシンから選ばれる少なくとも２つのアミノ酸残基を有するリパーゼ変異体；
（ａｃ）配列番号１０のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の２９位に相当する位置におけるチロシン、３１位に相当する位置におけるチロシン、３２位に相当する位置におけるグリシン、及び１８６位に相当する位置におけるグリンから選ばれる少なくとも２つのアミノ酸残基を有するリパーゼ変異体；
（ａｄ）配列番号１４のアミノ酸配列と少なくとも８３％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の３１位に相当する位置におけるチロシン、３２位に相当する位置におけるグリシン、７７位に相当する位置におけるリジン、及び１８１位に相当する位置におけるロイシンから選ばれる少なくとも２つのアミノ酸残基を有するリパーゼ変異体；
（ａｅ）配列番号１６のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の９０位に相当する位置におけるシステイン及び１８１位に相当する位置におけるロイシンを有するリパーゼ変異体。
【請求項３】
上記（ａ）、（ｃ）～（ｇ）、（ｉ）～（ｋ）、（ｎ）、（ｏ）、（ｒ）及び（ｔ）～（ｖ）から選択されるいずれかのリパーゼ変異体である、請求項１に記載のリパーゼ変異体。
【請求項４】
下記（ａａ－１）～（ａｅ）から選択されるいずれかのリパーゼ変異体である、請求項２に記載のリパーゼ変異体：
（ａａ－１）配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の３１位に相当する位置におけるチロシン及び３２位に相当する位置におけるグリシンを有するリパーゼ変異体；
（ａａ－２）配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の９０位に相当する位置におけるシステイン及び１８１位に相当する位置におけるロイシンを有するリパーゼ変異体；
（ａａ－３）配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の３２位に相当する位置におけるグリシン及び９０位に相当する位置におけるシステインを有するリパーゼ変異体；
（ａａ－４）配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の３１位に相当する位置におけるチロシン、３２位に相当する位置におけるグリシン、９０位に相当する位置におけるシステイン、及び１８１位に相当する位置におけるＬを有するリパーゼ変異体；
（ａｂ－１）配列番号８のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の１２５位に相当する位置におけるスレオニン及び１２６位に相当する位置におけるプロリンを有するリパーゼ変異体；
（ａｂ－２）配列番号８のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の３９位に相当する位置におけるリジン及び２９３位に相当する位置におけるグリシンを有するリパーゼ変異体；
（ａｂ－３）配列番号８のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の１２５位に相当する位置におけるスレオニン、１２６位に相当する位置におけるプロリン、及び２９３位に相当する位置におけるグリシンを有するリパーゼ変異体；
（ａｂ－４）配列番号８のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の３９位に相当する位置におけるリジン、１２５位に相当する位置におけるスレオニン、及び１２６位に相当する位置におけるプロリンを有するリパーゼ変異体；
（ａｂ－５）配列番号８のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の３９位に相当する位置におけるリジン、１２６位に相当する位置におけるプロリン、及び２９３位に相当する位置におけるグリシンを有するリパーゼ変異体；
（ａｂ－６）配列番号８のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の３９位に相当する位置におけるリジン、１２５位に相当する位置におけるスレオニン、１２６位に相当する位置におけるプロリン、及び２９３位に相当する位置におけるグリシンを有するリパーゼ変異体；
（ａｃ－１）配列番号１０のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の２９位に相当する位置におけるチロシン及び１８６位に相当する位置におけるグリシンを有するリパーゼ変異体；
（ａｃ－２）配列番号１０のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、又は配列番号２のアミノ酸配列の２９位に相当する位置におけるチロシン、３１位に相当する位置におけるチロシン、３２位に相当する位置におけるグリシン、及び１８６位に相当する位置におけるグリシンを有するリパーゼ変異体；
（ａｄ－１）配列番号１４のアミノ酸配列と少なくとも８３％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の３１位に相当する位置におけるチロシン及び３２位に相当する位置におけるグリシンを有するリパーゼ変異体；
（ａｄ－２）配列番号１４のアミノ酸配列と少なくとも８３％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の７７位に相当する位置におけるリジン及び１８１位に相当する位置におけるロイシンを有するリパーゼ変異体；
（ａｄ－３）配列番号１４のアミノ酸配列と少なくとも８３％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の３１位に相当する位置におけるチロシン、３２位に相当する位置におけるグリシン、及び１８１位に相当する位置におけるロイシンを有するリパーゼ変異体；
（ａｄ－４）配列番号１４のアミノ酸配列と少なくとも８３％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の３１位に相当する位置におけるチロシン、３２位に相当する位置におけるグリシン、７７位に相当する位置におけるリジン、及び１８１位に相当する位置におけるロイシンを有するリパーゼ変異体；
（ａｅ）配列番号１６のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の９０位に相当する位置におけるシステイン及び１８１位に相当する位置におけるロイシンを有するリパーゼ変異体。
【請求項５】
請求項１～４のいずれか１項に記載のリパーゼ変異体を含有する、酵素組成物。
【請求項６】
請求項１～４のいずれか１項に記載のリパーゼ変異体をコードするポリヌクレオチド。
【請求項７】
請求項６に記載のポリヌクレオチドを含むベクター又はＤＮＡ断片。
【請求項８】
請求項７に記載のベクター又はＤＮＡ断片を含有する形質転換細胞。
【請求項９】
微生物である、請求項８に記載の形質転換細胞。
【請求項１０】
大腸菌又はバチルス属細菌である、請求項９記載の形質転換細胞。
（【請求項１１】以降は省略されています）
発明の詳細な説明【技術分野】
【０００１】
本発明は、リパーゼ変異体に関する。
続きを表示（約 7,000 文字）【背景技術】
【０００２】
リパーゼは、脂質中のエステル結合を加水分解して脂肪酸を生成することによって油を含む汚れの除去に寄与し、洗浄用途において有用である。洗浄に有用なリパーゼとして、Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓｌａｎｕｇｉｎｏｓｕｓ由来のリパーゼ（以下ＴＬＬ）がＬＩＰＯＬＡＳＥ（登録商標）の商品名で販売されている。特許文献１にはＣｅｄｅｃｅａｓｐ－１６６４０株由来のリパーゼＬｉｐｒ１３９がＴＬＬと比較して優れた洗浄性能を有することが開示されている。特許文献２には、１つ又は複数の参照脂肪分解酵素と比較した場合に改善された洗浄性能を有するＰｒｏｔｅｕｓ属細菌由来リパーゼ（以下ＰｖＬｉｐ）の変異体が開示されている。特許文献３にはメタゲノム由来のリパーゼＬｉｐｒ１３８がＴＬＬと比較して優れた洗浄性能を有することが開示されている。Ｌｉｐｒ１３９、ＰｖＬｉｐ及びＬｉｐｒ１３８はＰｒｏｔｅｕｓ属細菌やＹｅｒｓｉｎｉａ属細菌に由来するリパーゼを含む同一のクレード（Ｐｒｏｔｅｕｓ／Ｙｅｒｓｉｎｉａクレード）に属するリパーゼである。
【０００３】
グラム陰性菌由来のリパーゼの多くは、活性型への折りたたみにリパーゼ特異的シャペロンを必要とし（非特許文献１）、異種発現による安価製造に課題を有する。特異的シャペロンの共発現によって異種発現が改善することが報告されている（非特許文献２）が、その生産性は低く、異種発現による安価製造には依然として大きな課題がある。一方、Ｐｒｏｔｅｕｓ／Ｙｅｒｓｉｎｉａクレードのバクテリアリパーゼは特異的シャペロンを必要とせず、異種発現による安価製造において優位性を持つ（非特許文献３、４）。
以上のように、Ｐｒｏｔｅｕｓ／Ｙｅｒｓｉｎｉａクレードのバクテリアリパーゼは洗浄への適性と安価製造可能性の両者において、洗浄用酵素として優れたポテンシャルを有する。
【０００４】
リパーゼは、エステル加水分解反応以外にも、エステル合成反応、エステル交換反応、アシドリシスなど様々な反応を触媒する。この反応性を利用して、洗浄、光学分割、バイオ燃料製造、油脂加工、廃水処理、パルプ製造、レザー製造など様々な用途でリパーゼが利用されている。非特許文献５及び６にはＬｉｐＣ１２（Ｌｉｐｒ１３８と同配列）のエステル合成用途における優れた性能が示されており、Ｐｒｏｔｅｕｓ／Ｙｅｒｓｉｎｉａクレードのバクテリアリパーゼは洗浄に限らず多様な産業用途における有用性が期待される。
【０００５】
アシルグリセロール中のエステル結合の位置特異性、脂肪酸鎖長特異性、光学分割におけるエナンチオ選択性といった基質特異性はリパーゼ種によって大きく異なる。近縁配列のリパーゼ間でもこれらの基質特異性には違いが見られ、最適な反応を行うためには反応系ごとにリパーゼのスクリーニングを行う必要がある。そのため、産業上利用できるリパーゼの配列多様性を広げることが求められている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
特表２０１５－５２３０７８号公報
国際公開公報第２０２０／０４６６１３号
特表２０１５－５２５２４８号公報
【非特許文献】
【０００７】
Hobson, Audrey H., et al. Proceedings of the National Academy of Sciences 90.12 (1993): 5682-5686.
Quyen, ThiDinh, ChiHai Vu, and GiangThi Thu Le. Microbial cell factories 11.1 (2012): 1-12.
Lee, Hong-Weon, et al. Biotechnology letters 22.19 (2000): 1543-1547.
Glogauer, Arnaldo, et al. Microbial cell factories 10.1 (2011): 1-15.
Madalozzo, Aline Dutra, et al. Journal of molecular catalysis b: enzymatic 116 (2015): 45-51.
Madalozzo, Aline Dutra, et al. Biocatalysis and Agricultural Biotechnology 8 (2016): 294-300.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明者らは、タンパク質の進化を表す有根系統樹上でＰｒｏｔｅｕｓ属細菌及びＹｅｒｓｉｎｉａ属細菌に由来するリパーゼを含むＰｒｏｔｅｕｓ／Ｙｅｒｓｉｎｉａクレードに属する多様な１６種のリパーゼについて、枯草菌における異種発現性を評価したところ、Ｐｒｏｔｅｕｓ／Ｙｅｒｓｉｎｉａクレードのリパーゼは異種発現にて優位性を持つとの報告があるにもかかわらず、明確な発現が確認できたのは３種のみであり、Ｐｒｏｔｅｕｓ／Ｙｅｒｓｉｎｉａクレードのリパーゼにおいて異種発現可能な配列の多様性が実際には小さいという課題を初めて見出した。よって、本発明は、異種発現性が向上したリパーゼ変異体を提供することに関する。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、斯かる課題に鑑み鋭意検討した結果、上記１６種のうちの８種のリパーゼ及びこれらに近縁の１種のリパーゼを用い、リパーゼの異種発現性を向上させる変異を見出した。
【００１０】
すなわち、本発明は、下記１）～１１）に係るものである。
１）下記（ａ）～（ｖ）から選択されるいずれかのリパーゼ変異体：
（ａ）配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも８２％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の１１８位に相当する位置にＤを有するリパーゼ変異体；
（ｂ）配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の３１位に相当する位置にＹを有するリパーゼ変異体；
（ｃ）配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも９１％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の３２位に相当する位置にＧを有するリパーゼ変異体；
（ｄ）配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の９０位に相当する位置にＣを有するリパーゼ変異体；
（ｅ）配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも９４％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の１８１位に相当する位置にＬを有するリパーゼ変異体；
（ｆ）配列番号６のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の２２２位に相当する位置にＡ、Ｔ、Ｈ又はＧを有するリパーゼ変異体；
（ｇ）配列番号８のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の３９位に相当する位置にＫを有するリパーゼ変異体；
（ｈ）配列番号８のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の１２５位に相当する位置にＴを有するリパーゼ変異体；
（ｉ）配列番号８のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の１２６位に相当する位置にＰを有するリパーゼ変異体；
（ｊ）配列番号８のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の２９３位に相当する位置にＧを有するリパーゼ変異体；
（ｋ）配列番号１０のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の２９位に相当する位置にＹを有するリパーゼ変異体；
（ｌ）配列番号１０のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の３１位に相当する位置にＹを有するリパーゼ変異体；
（ｍ）配列番号１０のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の３２位に相当する位置にＧを有するリパーゼ変異体；
（ｎ）配列番号１０のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の１８６位に相当する位置にＧを有するリパーゼ変異体；
（ｏ）配列番号１２のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の２０６位に相当する位置にＱを有するリパーゼ変異体；
（ｐ）配列番号１４のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の３１位に相当する位置にＹを有するリパーゼ変異体；
（ｑ）配列番号１４のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の３２位に相当する位置にＧを有するリパーゼ変異体；
（ｒ）配列番号１４のアミノ酸配列と少なくとも９７％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の７７位に相当する位置にＫを有するリパーゼ変異体；
（ｓ）配列番号１４のアミノ酸配列と少なくとも８３％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の１８１位に相当する位置にＬを有するリパーゼ変異体；
（ｔ）配列番号１６のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の９０位に相当する位置にＣを有するリパーゼ変異体；
（ｕ）配列番号１６のアミノ酸配列と少なくとも８１％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の１８１位に相当する位置にＬを有するリパーゼ変異体；
（ｖ）配列番号３４のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の２９位に相当する位置にＹを有するリパーゼ変異体。
２）下記（ａａ）～（ａｅ）から選択されるいずれかのリパーゼ変異体：
（ａａ）配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の３１位に相当する位置におけるＹ、３２位に相当する位置におけるＧ、９０位に相当する位置におけるＣ、及び１８１位に相当する位置におけるＬから選ばれる少なくとも２つのアミノ酸残基を有するリパーゼ変異体；
（ａｂ）配列番号８のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の３９位に相当する位置におけるＫ、１２５位に相当する位置におけるＴ、１２６位に相当する位置におけるＰ、及び２９３位に相当する位置におけるＧから選ばれる少なくとも２つのアミノ酸残基を有するリパーゼ変異体；
（ａｃ）配列番号１０のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の２９位に相当する位置におけるＹ、３１位に相当する位置におけるＹ、３２位に相当する位置におけるＧ、及び１８６位に相当する位置におけるＧから選ばれる少なくとも２つのアミノ酸残基を有するリパーゼ変異体；
（ａｄ）配列番号１４のアミノ酸配列と少なくとも８３％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の３１位に相当する位置におけるＹ、３２位に相当する位置におけるＧ、７７位に相当する位置におけるＫ、及び１８１位に相当する位置におけるＬから選ばれる少なくとも２つのアミノ酸残基を有するリパーゼ変異体；
（ａｅ）配列番号１６のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の９０位に相当する位置におけるＣ及び１８１位に相当する位置におけるＬを有するリパーゼ変異体。
３）１）又は２）に記載のリパーゼ変異体を含有する、酵素組成物。
４）１）又は２）に記載のリパーゼ変異体をコードするポリヌクレオチド。
５）４）に記載のポリヌクレオチドを含むベクター又はＤＮＡ断片。
６）５）に記載のベクター又はＤＮＡ断片を含有する形質転換細胞。
７）６）に記載の形質転換細胞を培養する工程を含む、リパーゼ変異体の製造方法。
８）下記（ｉ）～（ｘｘｉｉ）から選択されるいずれかの工程を含む、リパーゼ変異体の製造方法：
（ｉ）配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも８２％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の１１８位に相当する位置のアミノ酸残基をＤに置換する工程；
（ｉｉ）配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の３１位に相当する位置のアミノ酸残基をＹに置換する工程；
（ｉｉｉ）配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも９１％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の３２位に相当する位置のアミノ酸残基をＧに置換する工程；
（ｉｖ）配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の９０位に相当する位置のアミノ酸残基をＣに置換する工程；
（ｖ）配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも９４％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の１８１位に相当する位置のアミノ酸残基をＬに置換する工程；
（ｖｉ）配列番号６のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の２２２位に相当する位置のアミノ酸残基をＡ、Ｔ、Ｈ又はＧに置換する工程；
（ｖｉｉ）配列番号８のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の３９位に相当する位置のアミノ酸残基をＫに置換する工程；
（ｖｉｉｉ）配列番号８のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の１２５位に相当する位置のアミノ酸残基をＴに置換する工程；
（ｉｘ）配列番号８のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の１２６位に相当する位置のアミノ酸残基をＰに置換する工程；
（ｘ）配列番号８のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の２９３位に相当する位置のアミノ酸残基をＧに置換する工程；
（ｘｉ）配列番号１０のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の２９位に相当する位置のアミノ酸残基をＹに置換する工程；
（ｘｉｉ）配列番号１０のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の３１位に相当する位置のアミノ酸残基をＹに置換する工程；
（ｘｉｉｉ）配列番号１０のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の３２位に相当する位置のアミノ酸残基をＧに置換する工程；
（ｘｉｖ）配列番号１０のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の１８６位に相当する位置のアミノ酸残基をＧに置換する工程；
【発明の効果】
（【００１１】以降は省略されています）

関連特許