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公開番号2024075452
公報種別公開特許公報(A)
公開日2024-06-03
出願番号2022212629
出願日2022-11-22
発明の名称RNAの合成方法
出願人池田食研株式会社
代理人
主分類C12P 19/34 20060101AFI20240527BHJP(生化学;ビール;酒精;ぶどう酒;酢;微生物学;酵素学;突然変異または遺伝子工学)
要約【課題】 pH7.5以下、又は低温域若しくは高温域においても、効率よくRNAを合成できるRNAの合成方法を提供し、該合成方法に使用できるRNA合成用キットを提供するものである。
【解決手段】ミトコンドリアルRNAポリメラーゼ(MtRNAP)を用いて、pH7.5以下、又は低温域若しくは高温域においても、効率よくRNAを合成できることを見出し、本発明を完成した。
【選択図】なし
特許請求の範囲【請求項１】
ミトコンドリアルＲＮＡポリメラーゼ、鋳型ＤＮＡ、ＮＴＰ、マグネシウム塩及び緩衝液を含む反応液を用いて、ｐＨ７．５以下でインビトロ転写を行うことを特徴とする、ＲＮＡ合成方法。
続きを表示（約 230 文字）【請求項２】
３５℃以下又は４０℃以上でインビトロ転写を行うことを特徴とする、請求項１記載のＲＮＡ合成方法。
【請求項３】
ミトコンドリアルＲＮＡポリメラーゼ、鋳型ＤＮＡ及びＮＴＰを含む反応液を用いて、３５℃以下又は４０℃以上でインビトロ転写を行うことを特徴とする、ＲＮＡ合成方法。
【請求項４】
ミトコンドリアルＲＮＡポリメラーゼ、ＮＴＰ、マグネシウム塩及びｐＨ７．５以下の緩衝液を含む、ＲＮＡ合成用キット。

発明の詳細な説明【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＲＮＡの合成方法及びＲＮＡ合成用キット等に関する。
続きを表示（約 1,700 文字）【背景技術】
【０００２】
新型ウイルスの感染拡大に伴い、感染症ワクチンとしてｍＲＮＡワクチンが開発、利用されると共に、がん治療ワクチンとしてもｍＲＮＡの研究が進められる等、ＲＮＡ合成の需要が急速に高まっている。
【０００３】
現在、ＲＮＡの合成は、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ（Ｔ７ＲＮＡＰ）を使用して、Ｔ７ＲＮＡＰの認識配列であるＴ７プロモーターを含み、該プロモーターの下流に目的の配列を挿入したＤＮＡを鋳型として、インビトロ転写により行われている。Ｔ７ＲＮＡＰは、Ｔ７ファージ由来の単一サブユニットからなるＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼであり、安定性、正確性等を高めた改変酵素が開発されている（特許文献１及び２）。ファージ由来のＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼとしては、Ｔ７ＲＮＡＰの他に、Ｔ３ＲＮＡＰ、ＳＰ６ＲＮＡＰ等が知られている。
【０００４】
ファージ由来ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼと同様に、単一サブユニットからなるＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼとして、ミトコンドリアルＲＮＡポリメラーゼ（ＭｔＲＮＡＰ）が知られており、ＭｔＲＮＡＰは、転写因子を必要とすることが知られている（非特許文献１及び２）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
特表２０２２－５２１０９４号公報
特表２０２０－５３２９６３号公報
【非特許文献】
【０００６】
ＭｏｌＣｅｌｌ．，８１（２），２６８－２８０，２０２１
Ｎａｔｕｒｅ，２５，４７８（７３６８），２６９－２７３，２０１１
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、ｐＨ７．５以下、又は低温域若しくは高温域においても、効率よくＲＮＡを合成できるＲＮＡの合成方法を提供し、該合成方法に使用できるＲＮＡ合成用キットを提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明では、ミトコンドリアルＲＮＡポリメラーゼ（ＭｔＲＮＡＰ）を用いて、ｐＨ７．５以下、又は低温域若しくは高温域においても、効率よくＲＮＡを合成できることを見出し、本発明を完成した。
【０００９】
すなわち、本発明は、以下の［１］～［４］の態様に関する。
［１］ミトコンドリアルＲＮＡポリメラーゼ、鋳型ＤＮＡ、ＮＴＰ、マグネシウム塩及び緩衝液を含む反応液を用いて、ｐＨ７．５以下でインビトロ転写を行うことを特徴とする、ＲＮＡ合成方法。
［２］３５℃以下又は４０℃以上でインビトロ転写を行うことを特徴とする、［１］記載のＲＮＡ合成方法。
［３］ミトコンドリアルＲＮＡポリメラーゼ、鋳型ＤＮＡ及びＮＴＰを含む反応液を用いて、３５℃以下又は４０℃以上でインビトロ転写を行うことを特徴とする、ＲＮＡ合成方法。
［４］ミトコンドリアルＲＮＡポリメラーゼ、ＮＴＰ、マグネシウム塩及びｐＨ７．５以下の緩衝液を含む、ＲＮＡ合成用キット。
【発明の効果】
【００１０】
従来のＲＮＡ合成法では、Ｔ７ＲＮＡＰの酵素活性がｐＨ７．５以下の弱酸性領域で低下するため、ＲＮＡの安定性が高い弱酸性領域での効率的なＲＮＡ合成ができなかったが、本発明により、ＲＮＡの安定性が高いｐＨ７．５以下において、効率的なＲＮＡ合成が可能になった。また、Ｔ７ＲＮＡＰの酵素活性が３５℃以下で低下するため、ＲＮＡ分解酵素の影響を受けにくい３５℃以下の温度領域での効率的なＲＮＡ合成ができなかったが、本発明により、３５℃以下においても効率的なＲＮＡ合成が可能になった。さらに、Ｔ７ＲＮＡＰの酵素活性が４０℃以上で低下するため、温度に比例して反応速度が高まるという酵素の特性を利用した効率的なＲＮＡ合成ができなかったが、本発明により、４０℃以上においても効率的なＲＮＡ合成が可能になった。よって、ＲＮＡが安定な条件下で、より効率的なＲＮＡ合成ができるようになった。
【発明を実施するための形態】
（【００１１】以降は省略されています）

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