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公開番号2024035173
公報種別公開特許公報(A)
公開日2024-03-13
出願番号2023139190
出願日2023-08-29
発明の名称高感度PCR法
出願人学校法人近畿大学
代理人個人
主分類C12Q 1/686 20180101AFI20240306BHJP(生化学;ビール;酒精;ぶどう酒;酢;微生物学;酵素学;突然変異または遺伝子工学)
要約【課題】従来遺伝子の一塩基変異を識別するには、TaqManプローブを用いて行われていたが、遺伝子-プローブ間の結合親和性(融解温度)の差を利用して識別するので、不要なものも増幅される。したがって、一塩基変異を識別する精度、検出感度がともに低いという課題があった。
【解決手段】プルーフリーディング活性を有するDNAポリメラーゼと、
3’-末端から2番目にポリメラーゼ活性を阻害する人工型核酸が配置され、前記3’-末端に天然型のDNAが配置された化学修飾プライマーを用いる高感度PCR法では、3’-末端が標的となる塩基と一致しない場合、3’-末端を除去し、人工型核酸を露出させ、ポリメラーゼ活性を停止させるので、きわめて精度の高い検出が可能になる。
【選択図】図1
特許請求の範囲【請求項１】
プルーフリーディング活性を有するＤＮＡポリメラーゼと、
３’－末端から２番目にポリメラーゼ活性を阻害する人工型核酸が配置され、前記３’－末端に天然型のＤＮＡが配置された化学修飾プライマーを用いる高感度ＰＣＲ法。
続きを表示（約 360 文字）【請求項２】
さらに、サイバーグリーンを含むことを特徴とする請求項１に記載された高感度ＰＣＲ法。
【請求項３】
前記人工型核酸は、糖の２’位を２’－ＯＭｅ若しくは２’－ＯＣＨ
２
ＣＨ
２
ＯＭｅで置換したＲＮＡ誘導体である請求項１または２の何れかに記載された高感度ＰＣＲ法。
【請求項４】
前記人工型核酸を含むプライマーの各塩基間の骨格はリン酸ジエステル結合若しくはホスホロチオエート結合の何れかである請求項１または２の何れかに記載された高感度ＰＣＲ法。
【請求項５】
前記化学修飾プライマーの前記３’－末端から３番目から５’－末端までは、ポリメラーゼ活性を阻害しないヌクレオチドである請求項１または２の何れかに記載された高感度ＰＣＲ法。

発明の詳細な説明【技術分野】
【０００１】
本発明は一塩基の変異型を高精度で検出することができる高感度ＰＣＲ法に関するものである。
続きを表示（約 1,500 文字）【背景技術】
【０００２】
遺伝子の一塩基変異を識別する場合はＴａｑＭａｎプローブを用いる方法が良く使われている。
【０００３】
特許文献１には、ＴａｑＭａｎプローブに加えてポリメラーゼの５’－エクソヌクレアーゼ活性により分解されないＷＴ（ワイルドタイプ）ブロッカー核酸断片を、変異点を含む領域に結合させたのち、プライマーを結合させＰＣＲを行う。ＤＮＡに変異点があれば、ＷＴブロッカー核酸断片は変異型ＤＮＡへの結合が弱く、ＰＣＲは行われるが、変異点のない野生型ＤＮＡには強く結合して野生型のＰＣＲを妨害する。一方、ＴａｑＭａｎプローブは反対に野生型ＤＮＡへの結合は弱く、変異型ＤＮＡにより強く結合してポリメラーゼの５’－エクソヌクレアーゼ活性により分解されてＰＣＲの進行に伴って蛍光が増強すると開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
国際公開第２０１６／０９３３３３号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
ＴａｑＭａｎプローブを用いた方法は、遺伝子－プローブ間の結合親和性（融解温度）の差を利用して遺伝子の一塩基変異を識別するので、ＴａｑＭａｎプローブもＷＴブロッカーも変異型ＤＮＡか野生型ＤＮＡの一方に１００％結合し、他方に全く結合しない温度設定は原理的に不可能である。ＴａｑＭａｎプローブが目的外の野生型ＤＮＡにも、ＷＴブロッカーが目的外の変異型ＤＮＡにもある程度結合する分だけ検出感度を低下させることになる。そのため、同一細胞内に発現する野生型遺伝子とその一塩基変異遺伝子に由来するｍＲＮＡをリアルタイムＰＣＲによって定量解析することはできず、一塩基変異遺伝子を標的とした薬物の効果を遺伝子レベルで定量解析する手段がなかった。
【０００６】
したがって、まず、検出感度が５０－１００コピー以上の検体が検出限界となる。つまり、それ以下の検体数で増幅するほどの高感度性は有していない。また、変異識別精度（野生型中に混在する変異型比率）は１－５％程度が限界であった。また、個々の評価系毎に精密なプライマー、プローブ設計、反応温度設定が必要となり、検査毎に変異識別精度、検出精度にバラツキが生じやすくなる。また、ＴａｑＭａｎプローブは高価である。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明に係る高感度ＰＣＲ法は上記の課題に鑑みて想到されたものであり、ポリメラーゼ活性を阻害するヌクレオチドも３’－末端になければ増幅が可能であるが、３’－末端に露出すると、ポリメラーゼ活性が阻害されるという性質を利用することで、一塩基変異を検出する。
【０００８】
より具体的に本発明に係る高感度ＰＣＲ法は、
プルーフリーディング活性を有するＤＮＡポリメラーゼと、
３’－末端から２番目にポリメラーゼ活性を阻害する人工型核酸が配置され、前記３’－末端に天然型のＤＮＡが配置された化学修飾プライマーを用いることを特徴とする。
【発明の効果】
【０００９】
本発明は新規化学修飾プライマーと、プルーフリーディング活性を有するＤＮＡポリメラーゼを組み合わせたサイバーグリーン法を利用するＰＣＲ技術である。融解温度の違いに基づく検出は行わないので、従来とは異なる原理による一塩基変異の識別方法と言える。
【００１０】
したがって、非常に少ないコピー数（１０コピー数からでも可能）の検出対象遺伝子であっても増幅ができ、また、０．０１％の混入量でも明確に検出が可能である。
（【００１１】以降は省略されています）

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