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公開番号2024034839
公報種別公開特許公報(A)
公開日2024-03-13
出願番号2022139356
出願日2022-09-01
発明の名称リパーゼの探索方法
出願人花王株式会社
代理人弁理士法人アルガ特許事務所
主分類C12Q 1/34 20060101AFI20240306BHJP(生化学;ビール;酒精;ぶどう酒;酢;微生物学;酵素学;突然変異または遺伝子工学)
要約【課題】界面活性剤による活性阻害に対して耐性を有し、及び/又は界面活性剤存在下での優れた洗浄力を示すリパーゼを効率的に探索できるリパーゼの探索方法の提供。
【解決手段】リパーゼ配列群を用いて祖先配列設計法によりリパーゼの祖先配列を設計する工程、
設計した祖先配列からなるリパーゼの界面活性剤存在下のリパーゼ活性及び界面活性剤存在下の洗浄力の少なくとも一方を測定する工程、及び
測定した結果を標準リパーゼの界面活性剤存在下のリパーゼ活性及び界面活性剤存在下の洗浄力の少なくとも一方と比較する工程、
を含むリパーゼの探索方法。
【選択図】なし
特許請求の範囲【請求項１】
リパーゼ配列群を用いて祖先配列設計法によりリパーゼの祖先配列を設計する工程、
設計した祖先配列からなるリパーゼの界面活性剤存在下のリパーゼ活性及び界面活性剤存在下の洗浄力の少なくとも一方を測定する工程、及び
測定した結果を標準リパーゼの界面活性剤存在下のリパーゼ活性及び界面活性剤存在下の洗浄力の少なくとも一方と比較する工程、
を含むリパーゼの探索方法。
続きを表示（約 590 文字）【請求項２】
リパーゼ配列群がバクテリアリパーゼ配列群である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
リパーゼ配列群がバクテリアリパーゼのサブファミリーＩ．１又はサブファミリーＩ．２に属するリパーゼ配列を少なくとも１配列含む、請求項１記載の方法。
【請求項４】
設計した祖先配列からＱＧＬＰクレードに属する祖先配列を選択する工程をさらに含む、請求項１記載の方法。
【請求項５】
ＱＧＬＰクレードに属する祖先配列がＰｒｏｔｅｕｓ/Ｙｅｒｓｉｎｉａクレードに属するリパーゼの現存配列の祖先配列に相当する、請求項４記載の方法。
【請求項６】
洗浄力が低温での洗浄力である、請求項１記載の方法。
【請求項７】
設計した祖先配列を改変して改変祖先配列を設計する工程、
設計した改変祖先配列からなるリパーゼの界面活性剤存在下のリパーゼ活性及び界面活性剤存在下の洗浄力の少なくとも一方を測定する工程、及び
測定した結果を標準リパーゼの界面活性剤存在下のリパーゼ活性及び界面活性剤存在下の洗浄力の少なくとも一方と比較する工程、
をさらに含む、請求項１記載の方法。
【請求項８】
改変が祖先配列におけるアミノ酸置換又は祖先配列のキメラ化である、請求項７記載の方法。

発明の詳細な説明【技術分野】
【０００１】
本発明は、リパーゼの探索方法に関する。
続きを表示（約 2,500 文字）【背景技術】
【０００２】
リパーゼは、洗濯洗剤、食器用洗剤、油脂加工、パルプ処理、飼料、医薬中間体合成など様々な用途において有用である。洗浄においては、リパーゼはトリグリセリドを加水分解して脂肪酸を生成することによって油を含む汚れの除去に寄与する。
【０００３】
現行の洗浄組成物や洗浄環境は、リパーゼの活性や洗浄効果を阻害する様々な成分を含んでおり、そのような条件下で機能するリパーゼが求められている。洗浄に有用なリパーゼとして、Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓｌａｎｕｇｉｎｏｓｕｓ由来のリパーゼ（以下ＴＬＬ）がＬＩＰＯＬＡＳＥ（登録商標）の商品名で販売されている。特許文献１にはＣｅｄｅｃｅａｓｐ－１６６４０株由来のリパーゼＬｉｐｒ１３９がＴＬＬと比較して優れた洗浄性能を有することが開示されている。特許文献２には、１つ又は複数の参照脂肪分解酵素と比較した場合に改善された洗浄性能を有するＰｒｏｔｅｕｓ属細菌由来リパーゼ（以下ＰｖＬｉｐ）の変異体が開示されている。特許文献３にはメタゲノム由来のリパーゼＬｉｐｒ１３８がＴＬＬと比較して優れた洗浄性能を有することが開示されている。Ｌｉｐｒ１３９、ＰｖＬｉｐ及びＬｉｐｒ１３８はＰｒｏｔｅｕｓ属細菌やＹｅｒｓｉｎｉａ属細菌に由来するリパーゼを含む同一のクレード（Ｐｒｏｔｅｕｓ／Ｙｅｒｓｉｎｉａクレード）に属するリパーゼである。
【０００４】
バクテリアリパーゼは８つのファミリーに分類される（非特許文献１）。そのうちサブファミリーＩ．１又はＩ．２に属するグラム陰性菌由来のリパーゼの多くは、活性型への折りたたみにリパーゼ特異的シャペロンを必要とし（非特許文献２）、異種発現による安価製造に課題を有する。特異的シャペロンの共発現によって異種発現が改善することが報告されている（非特許文献３）が、その生産性は低く、異種発現による安価製造には依然として大きな課題がある。一方、サブファミリーＩ．１のリパーゼのうちＰｒｏｔｅｕｓ／Ｙｅｒｓｉｎｉａクレードに属するバクテリアリパーゼの一部は特異的シャペロンを必要とせず、異種発現による安価製造において優位性を持つ（非特許文献４、５）。以上のように、異種発現による安価製造が可能であり、様々な洗浄環境で機能を発揮するリパーゼの探索が精力的に行われている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
特表２０１５－５２３０７８号公報
国際公開公報第２０２０／０４６６１３号
特表２０１５－５２５２４８号公報
【非特許文献】
【０００６】
Arpigny JL, Jaeger KE. The Biochemical journal 343 Pt 1(Pt 1) (1999): 177-183.
Hobson, Audrey H., et al. Proceedings of the National Academy of Sciences 90.12 (1993): 5682-5686.
Quyen, ThiDinh, ChiHai Vu, and GiangThi Thu Le. Microbial cell factories 11.1 (2012): 1-12.
Lee, Hong-Weon, et al. Biotechnology letters 22.19 (2000): 1543-1547.
Glogauer, Arnaldo, et al. Microbial cell factories 10.1 (2011): 1-15.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
リパーゼは洗浄組成物中に含まれる界面活性剤によってその活性が阻害されることが知られている。実際に本発明者らが検証した限り、洗浄への適性が開示されている公知のリパーゼは、ＴＬＬ、Ｌｉｐｒ１３９、ＰｖＬｉｐ及びＬｉｐｒ１３８のいずれもが界面活性剤の共存によって大きな活性阻害を受けた。界面活性剤による活性阻害は洗浄用リパーゼの大きな課題である。また、リパーゼは洗浄用途に限らずパルプ処理などの産業用途においても界面活性剤と共に使用されることが多く、界面活性剤による活性阻害は産業用リパーゼ全体の課題でもある。したがって、界面活性剤による活性阻害に対して耐性を有し、及び／又は界面活性剤存在下での優れた洗浄力を示すリパーゼを効率的に探索する方法が求められている。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、斯かる課題に鑑み鋭意検討した結果、祖先配列設計法によりリパーゼの祖先配列を設計することで、界面活性剤による活性阻害に対する耐性及び界面活性剤存在下での優れた洗浄力の少なくとも一方を有するリパーゼを効率的に取得できることを見出した。
一般に祖先型の酵素は、高い耐熱性や高い至適温度を有するといった特性を示すことが知られているが、界面活性剤による活性阻害に関する特性や低温における洗浄作用に関する特性はこれまで全く知られておらず、上記結果は予想外のものであった。
【０００９】
すなわち、本発明は、リパーゼ配列群を用いて祖先配列設計法によりリパーゼの祖先配列を設計する工程、設計した祖先配列からなるリパーゼの界面活性剤存在下のリパーゼ活性及び界面活性剤存在下の洗浄力の少なくとも一方を測定する工程、及び測定した結果を標準リパーゼの界面活性剤存在下のリパーゼ活性及び界面活性剤存在下の洗浄力の少なくとも一方と比較する工程、を含むリパーゼの探索方法を提供する。
【発明の効果】
【００１０】
本発明の探索方法を用いることで、界面活性剤による活性阻害に対する耐性及び界面活性剤存在下での優れた洗浄力の少なくとも一方を有するリパーゼを効率的に取得することができる。
【図面の簡単な説明】
（【００１１】以降は省略されています）

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