特許ウォッチ

公開番号2024056367
公報種別公開特許公報(A)
公開日2024-04-23
出願番号2022163190
出願日2022-10-11
発明の名称逆転写反応用組成物
出願人東洋紡株式会社
代理人
主分類C12N 9/10 20060101AFI20240416BHJP(生化学;ビール;酒精;ぶどう酒;酢;微生物学;酵素学;突然変異または遺伝子工学)
要約【課題】安定性に優れた逆転写反応用組成物を提供すること。
【解決手段】本発明の逆転写反応用組成物は、逆転写活性を有する酵素及びMPCポリマーを含むことを特徴とする。MPCポリマーは、アニオン性官能基を有するモノマーを構成単位として含むMPCポリマーであることが好ましく、2-メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンと、アニオン性官能基を有するビニルモノマーとを構成単位として含む共重合体のMPCポリマーであることが更に好ましい。
【選択図】なし
特許請求の範囲【請求項１】
ＭＰＣポリマー及び逆転写活性を有する酵素を含む、逆転写反応用組成物。
続きを表示（約 740 文字）【請求項２】
ＭＰＣポリマーが、アニオン性官能基を有するモノマーを構成単位として含む、請求項１に記載の逆転写反応用組成物。
【請求項３】
ＭＰＣポリマーが、２－メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンと、アニオン性官能基を有するビニルモノマーとを構成単位として含む共重合体である、請求項１又は２に記載の逆転写反応用組成物。
【請求項４】
逆転写活性を有する酵素が、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭＭＬＶ）由来の逆転写酵素、トリ骨髄芽球症ウイルス（ＡＭＶ）由来の逆転写酵素、及びヒト免疫不全ウイルス１型（ＨＩＶ－１）由来の逆転写酵素からなる群より選択される少なくとも１種である、請求項１又は２に記載の逆転写反応用組成物。
【請求項５】
ＭＰＣポリマーの濃度が、組成物全体に対して０．０００２％以上である、請求項１又は２に記載の逆転写反応用組成物。
【請求項６】
更に多価アルコールを含む、請求項１又は２に記載の逆転写反応用組成物。
【請求項７】
多価アルコールが、グリセロール、グリコール、及び糖アルコールからなる群より選択される少なくとも１種である、請求項６に記載の逆転写反応用組成物。
【請求項８】
更に２価陽イオンを含む、請求項１又は２に記載の逆転写反応用組成物。
【請求項９】
２価陽イオンが、マグネシウムイオン及びマンガンイオンからなる群より選択される少なくとも１種である、請求項８に記載の逆転写反応用組成物。
【請求項１０】
更にデオキシヌクレオチドを含む、請求項１又は２に記載の逆転写反応用組成物。
（【請求項１１】以降は省略されています）
発明の詳細な説明【技術分野】
【０００１】
本発明は、逆転写活性を有する酵素の安定性を向上させる方法、及びそれにより得られる逆転写反応用組成物等に関する。
続きを表示（約 3,900 文字）【背景技術】
【０００２】
逆転写酵素はＲＮＡを鋳型としてＤＮＡを合成する酵素であり、遺伝子工学や分子生物学では必要不可欠な酵素である。例えば、モロニ―マウス白血病ウイルス（Ｍｏｌｏｎｅｙｍｕｒｉｎｅｌｅｕｋｅｍｉａｖｉｒｕｓ：ＭＭＬＶ）逆転写酵素、トリ骨髄芽球症ウイルス（Ａｖｉａｎｍｙｅｌｏｂｓｌａｓｔｏｓｉｓｖｉｒｕｓ：ＡＭＶ）逆転写酵素、ヒト免疫不全ウイルス１型（ＨｕｍａｎＩｍｍｕｎｏｄｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙＶｉｒｕｓ１型：ＨＩＶ－１）逆転写酵素、またそれらの改変体が市販されている。これらの酵素は核酸増幅法と組み合わせることで、数コピーの標的ＲＮＡを可視化可能なレベル、すなわち数億コピー以上に増幅することができ、研究分野のみならず、遺伝子診断、臨床検査といった医療分野、あるいは、食品や環境中の微生物検査等においても、広く用いられている。
【０００３】
代表的な核酸増幅法であるＰＣＲ（ＰｏｌｙｍｅｒａｓｅＣｈａｉｎＲｅａｃｔｉｏｎ）は、（１）熱処理によるＤＮＡ変性（２本鎖ＤＮＡから１本鎖ＤＮＡへの解離）、（２）鋳型１本鎖ＤＮＡへのプライマーのアニーリング、（３）ＤＮＡポリメラーゼを用いた前記プライマーの伸長、という３ステップを１サイクルとし、このサイクルを繰り返すことによって、試料中の標的核酸を増幅する方法である。この増幅に使用される酵素、ＤＮＡポリメラーゼの反応はＤＮＡに特異的であるため、対象がＲＮＡの場合、逆転写酵素によって、一度ＤＮＡに変換する逆転写（ＲｅｖｅｒｓｅＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ；ＲＴ）を実施してから上記増幅反応を行う必要がある。この逆転写反応とＰＣＲを組み合わせた反応をＲＴ－ＰＣＲと呼び、ＲＴ－ＰＣＲには、（１）ＲＴ、ＰＣＲを非連続に実施する２ステップＲＴ－ＰＣＲ、（２）ＲＴ、ＰＣＲを連続的に実施する１ステップＲＴ－ＰＣＲが存在する。
【０００４】
逆転写反応には逆転写酵素以外にも、緩衝剤、マグネシウム等の補因子、デオキシヌクレオチドが通常必要とされる。そのため、市販の逆転写酵素は、例えば、緩衝剤、塩、界面活性剤などを含む５０％程度のグリセロール溶液中で保存され、使用時に緩衝剤及びマグネシウムなどを含む反応Ｂｕｆｆｅｒと混合して用いられる試薬の形態として販売されたり、又は緩衝剤及びマグネシウム等を含む反応Ｂｕｆｆｅｒと酵素が最初からすべて混合されて1液化（マスターミックス化）されており、使用時にそのまま用いることが可能な試薬の形態などで販売されている。これらの逆転写反応は一般に、核酸増幅法とは独立して実施され、その後、核酸増幅法と組み合わされる。また、例えば、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ製のＴａｑＰａｔｈ１－ＳｔｅｐＲＴ－ｑＰＣＲＭａｓｔｅｒＭｉｘ，ＣＧのように逆転写反応のマスターミックスにＤＮＡポリメラーゼが含有され、ＲＴ－ＰＣＲ用のマスターミックス試薬として、ＲＴ、ＰＣＲを連続的に実施する１ステップＲＴ－ＰＣＲに利用される試薬等も存在する。
【０００５】
このような逆転写酵素試薬は一般的に－２０℃から－８０℃で保存される。そして、逆転写酵素は、耐熱性であるＤＮＡポリメラーゼに比べ、安定性が低いことが多く、逆転写酵素の失活が実験の再現性の低下などにつながることが知られている。しかし、一般的にこれらの試薬は使用時には４℃などで融解または一時保管されるため、何回か使用した後は酵素が徐々に失活し、試薬の再購入や再調製を検討する必要があり、多大なる労力及びコストがかかっていた。
【０００６】
このような逆転写活性を有する酵素の失活は、ＲＮＡの発現解析など逆転写反応を行う研究において時間、労力、費用の面で負担を大きくする。また、ＲＮＡウイルス検査などのＲＮＡをターゲットとする検査を行う必要がある臨床の現場では、このような逆転写活性を有する酵素の失活が誤った診断につながるため、これらの酵素の安定化が強く望まれている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は上記従来技術に鑑みてなされたものであり、逆転写活性を有する酵素の安定性を向上させ、例えば、長期に保存しても安定な逆転写反応用組成物を提供することを目的とする。安定性の向上した逆転写反応用組成物とすることで、例えば、－２０℃から－８０℃よりも高い温度で一定期間保管されても逆転写活性を有する酵素の失活を抑えることができ、逆転写反応を行う実験や試験の再現性を高めることができる。また、逆転写活性を有する酵素を含む試薬の再購入・再調製を抑えることで、無駄な費用と手間等を減らし、低コストで実験、試験を実施することができるようになる。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者は、上記事情に鑑み、鋭意研究を行った結果、２－メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンを含むポリマー（ＭＰＣポリマー）、特にはアニオン性官能基を有するモノマーを構成単位として含む共重合体のＭＰＣポリマーを、逆転写活性を有する酵素と共存させることで、逆転写活性を有する酵素の保存安定性を向上させることができることを見出し、本発明に到達した。
【０００９】
代表的な本願発明は、以下の通りである。
［項１］ＭＰＣポリマー及び逆転写活性を有する酵素を含む、逆転写反応用組成物。
［項２］ＭＰＣポリマーが、アニオン性官能基を有するモノマーを構成単位として含む、項１に記載の逆転写反応用組成物。
［項３］ＭＰＣポリマーが、２－メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンと、アニオン性官能基を有するビニルモノマーとを構成単位として含む共重合体である、項１又は２に記載の逆転写反応用組成物。
［項４］逆転写活性を有する酵素が、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭＭＬＶ）由来の逆転写酵素、トリ骨髄芽球症ウイルス（ＡＭＶ）由来の逆転写酵素、及びヒト免疫不全ウイルス１型（ＨＩＶ－１）由来の逆転写酵素からなる群より選択される少なくとも１種である、項１～３のいずれかに記載の逆転写反応用組成物。
［項５］ＭＰＣポリマーの濃度が、組成物全体に対して０．０００２％以上である、項１～４のいずれかに記載の逆転写反応用組成物。
［項６］更に多価アルコールを含む、項１～５のいずれかに記載の逆転写反応用組成物。
［項７］多価アルコールが、グリセロール、グリコール、及び糖アルコールからなる群より選択される少なくとも１種である、項６に記載の逆転写反応用組成物。
［項８］更に２価陽イオンを含む、項１～７のいずれかに記載の逆転写反応用組成物。
［項９］２価陽イオンが、マグネシウムイオン及びマンガンイオンからなる群より選択される少なくとも１種である、項８に記載の逆転写反応用組成物。
［項１０］更にデオキシヌクレオチドを含む、項１～９のいずれかに記載の逆転写反応用組成物。
［項１１］更にＤＮＡポリメラーゼを含む、項１～１０のいずれかに記載の逆転写反応用組成物。
［項１２］更に界面活性剤を含む、項１～１１のいずれかに記載の逆転写反応用組成物。
［項１３］界面活性剤が、非イオン性界面活性剤である、項１２に記載の逆転写反応用組成物。
［項１４］３７℃で４日間保管した場合に６０％以上の残存活性率を示す、項１～１３のいずれかに記載の逆転写反応用組成物。
［項１５］ＲＴ－ＰＣＲ反応に用いられる、項１～１４のいずれかに記載の逆転写反応用組成物。
［項１６］マスターミックス試薬として用いられる、項１～１５のいずれかに記載の逆転写反応用組成物。
［項１７］逆転写活性を有する酵素をＭＰＣポリマーと共存させることを特徴とする、逆転写活性を有する酵素の安定化方法。
［項１８］ＭＰＣポリマーが、アニオン性官能基を有するモノマーを構成単位として含む、項１７に記載の安定化方法。
［項１９］ＭＰＣポリマーが、２－メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンと、アニオン性官能基を有するビニルモノマーとを構成単位として含む共重合体である、項１７又は１８に記載の安定化方法。
［項２０］逆転写活性を有する酵素を含有する溶液中においてＭＰＣポリマーを共存させる、項１７～１９のいずれかに記載の安定化方法。
［項２１］逆転写活性を有する酵素を含有する溶液を３７℃で４日間保管した場合の残存活性率を６０％以上にする、項１７～２０のいずれかに記載の安定化方法。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によって、逆転写活性を有する酵素の安定性を向上させることができ、例えば、長期に保存しても安定な逆転写反応用組成物を提供することができる。逆転写活性を有する酵素の失活を抑えることで、逆転写反応に用いる試薬の再購入・再調製の手間を低減し、低コストでの逆転写反応を行う実験や試験を可能にする。また、逆転写活性を有する酵素の失活による再現性低下を防ぐことができ、安定した実験結果、試験結果を得ることが可能になる。研究用途だけでなく、臨床分野にも大いに寄与し得る。
【発明を実施するための形態】
（【００１１】以降は省略されています）

関連特許