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公開番号2024074958
公報種別公開特許公報(A)
公開日2024-05-31
出願番号2024062662,2023003968
出願日2024-04-09,2019-08-28
発明の名称合成メッセンジャーRNAを用いて尿細胞を神経幹細胞へ直接逆分化する方法
出願人ステムラボ・インコーポレイテッド
代理人個人,個人,個人
主分類C12N 15/12 20060101AFI20240524BHJP(生化学;ビール;酒精;ぶどう酒;酢;微生物学;酵素学;突然変異または遺伝子工学)
要約【課題】本発明の目的は、尿細胞から神経幹細胞への逆分化を誘導する組成物を提供することである。本発明の他の目的は、尿細胞から神経幹細胞への逆分化を誘導する方法を提供することである。本発明さらに他の目的は、尿細胞から逆分化した神経幹細胞を有効成分として、神経損傷疾患の予防または治療用薬学的組成物を提供することである。
【解決手段】本発明は、逆分化因子Oct4、Sox2、Klf4及びGlis1のmRNAを導入して、尿細胞から神経幹細胞の逆分化誘導方法及び前記方法により誘導された神経幹細胞を有効成分とする神経損傷疾患の予防または治療用組成物に関する。
【選択図】なし
特許請求の範囲【請求項１】
（ｉ）Ｏｃｔ４タンパク質をコードする核酸と、
（ｉｉ）Ｓｏｘ２タンパク質をコードする核酸と、
（ｉｉｉ）Ｋｌｆ４タンパク質をコードする核酸と、
（ｉｖ）Ｇｌｉｓ１タンパク質をコードする核酸と、
（ｖ）ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地及びＮｅｕｒｏｂａｓａｌ培地を１：１の体積比で混合することによって得られる神経幹細胞誘導培地であって、前記神経幹細胞誘導培地は、Ｎ２、Ｂ２７、ｈｕｍａｎＬＩＦ、ＳＢ４３１５４２、ＣＨＩＲ９９０２１、ｐｕｒｍｏｒｐｈａｍｉｎｅ、ｆｏｌｓｋｏｌｉｎ、ｓｏｄｉｕｍｂｕｔｙｒａｔｅ及びアスコルビン酸２－リン酸塩（ａｓｃｏｒｂｉｃａｃｉｄ２－ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）を含む、神経幹細胞誘導培地と
を含む、尿細胞から神経幹細胞への直接逆分化を誘導する組成物。
続きを表示（約 880 文字）【請求項２】
前記尿細胞は、尿中に含まれる脱落した体細胞である、請求項１に記載の尿細胞から神経幹細胞への直接逆分化を誘導する組成物。
【請求項３】
前記Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４及びＧｌｉｓ１タンパク質をコードする核酸は、合成ｍＲＮＡである、請求項１に記載の尿細胞から神経幹細胞への直接逆分化を誘導する組成物。
【請求項４】
（ａ）尿から尿細胞を分離培養する段階と、
（ｂ）前記培養した尿細胞に請求項１または３に記載の組成物を導入する段階と、
（ｃ）前記組成物が導入された尿細胞を神経幹細胞誘導培地で７－１０日間培養して神経幹細胞へ直接逆分化を誘導する段階と、
（ｄ）前記神経幹細胞誘導培地によって直接逆分化を誘導した細胞から神経幹細胞様の特性を持つ神経幹細胞株を選別する段階と、
を含み、
前記（ｃ）段階において、前記神経幹細胞誘導培地は、ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地及びＮｅｕｒｏｂａｓａｌ培地を１：１の体積比で混合し、前記培地混合物に、Ｎ２、Ｂ２７、ｈｕｍａｎＬＩＦ、ＳＢ４３１５４２、ＣＨＩＲ９９０２１、ｐｕｒｍｏｒｐｈａｍｉｎｅ、ｆｏｌｓｋｏｌｉｎ、ｓｏｄｉｕｍｂｕｔｙｒａｔｅ及びアスコルビン酸２－リン酸塩（ａｓｃｏｒｂｉｃａｃｉｄ２－ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）を添加することによって得られる、
尿細胞から神経幹細胞への直接逆分化を誘導する方法。
【請求項５】
前記（ｂ）段階において、前記Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４及びＧｌｉｓ１タンパク質をコードする合成ｍＲＮＡの導入は、電気穿孔法（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）を用いて前記合成ｍＲＮＡを導入させるものである、請求項４に記載の尿細胞から神経幹細胞への直接逆分化を誘導する方法。
【請求項６】
前記神経幹細胞誘導培地における培養は、低酸素（Ｏ
２
ｈｙｐｏｘｉａ）の条件で行われるものである、請求項４に記載の尿細胞から神経幹細胞への直接逆分化を誘導する方法。

発明の詳細な説明【技術分野】
【０００１】
本発明は、尿細胞から神経幹細胞への直接逆分化方法、及び前記方法により製造された直接逆分化した神経幹細胞を含む神経損傷疾患の治療のための薬学的組成物に関する。
続きを表示（約 1,400 文字）【背景技術】
【０００２】
幹細胞（ｓｔｅｍｃｅｌｌ）とは、無限の自己増殖能力及び身体内で必要とされる特定の細胞及び組織への分化能を持つ細胞を意味する。幹細胞は、その種類を３つに分類しており、その種類としては、初期胚から分離した胚性幹細胞（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃｓｔｅｍｃｅｌｌ、ＥＳ細胞）、胚期の原始生殖細胞から分離した胚性生殖細胞（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃｇｅｒｍｃｅｌｌ、ＥＧ細胞）、及び多能性成体幹細胞（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔａｄｕｌｔｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｃｅｌｌ、ＭＡＰＣ細胞）がある。
【０００３】
幹細胞は、特化した機能を持つ細胞に分化する潜在力を有しているので、様々な臓器の機能回復のための細胞治療剤としての研究対象となっており、最近では整形と美容に至るまで、その活用範囲が拡大している傾向にある。
【０００４】
成体幹細胞の体内における役割は、大きく２つに要約できるが、第一は、幹細胞そのものが私たちの体で損傷した組織や細胞に分化し、再び再生させる役割であり、第二は、一生の間に持続的に成長因子及びサイトカインなどのタンパク質を分泌して近くの細胞の成長及び再生を助ける役割を果たす。
【０００５】
直接逆分化（ｄｉｒｅｃｔｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ）方式は、体細胞を望む他のタイプの細胞に転換できる技術である。日本の山中教授の逆分化（ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ）とは異なり、万能性幹細胞の状態を経ないので、少ない時間と高効率を示すとともに、万能性幹細胞の腫瘍発生のリスクや追加分化費用などを解決できる。しかし、現在行われている直接逆分化方式は、細胞源としてマウス細胞を主に用いてヒト体細胞で同一に再現される確率が高くない。また、ヒト体細胞の中ではよく皮膚細胞（線維芽細胞）を用いるが、この場合、侵襲的な方式の細胞源採取方法が必要となり、供与者の苦痛、安全性のリスクをもたらして利便性が低下する。また、直接逆分化時に要求される逆分化因子（遺伝子）導入方式において主にウイルスを用いているため、臨床的利用が困難であり、ウイルスを用いた遺伝子挿入システム（ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ－ｓｙｓｔｅｍ）の場合、誘電体に無分別な挿入による変異を誘発するため、治療用として適していない。
【０００６】
そこで、本発明者らは、細胞源として採取が容易なヒト尿由来細胞を用いており、逆分化因子の細胞導入に合成ｍＲＮＡのトランスフェクション（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）を用いることにより前記問題を解決し、尿細胞から神経幹細胞への高効率の直接逆分化に要求される最適の培養条件を確認して、本発明を完成した。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
韓国公開特許第１０－２０１３－００８７０２０号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の目的は、尿細胞から神経幹細胞への逆分化を誘導する組成物を提供することである。
【０００９】
本発明の他の目的は、尿細胞から神経幹細胞への逆分化を誘導する方法を提供することである。
【００１０】
本発明さらに他の目的は、尿細胞から逆分化した神経幹細胞を有効成分として、神経損傷疾患の予防または治療用薬学的組成物を提供することである。
【課題を解決するための手段】
（【００１１】以降は省略されています）

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