特許ウォッチ

公開番号2024059627
公報種別公開特許公報(A)
公開日2024-05-01
出願番号2024010827,2021507595
出願日2024-01-29,2019-08-16
発明の名称核酸の増幅のための試薬、混合物、キット、および方法
出願人ライフテクノロジーズコーポレーション
代理人個人,個人,個人,個人,個人,個人
主分類C12N 15/11 20060101AFI20240423BHJP(生化学;ビール;酒精;ぶどう酒;酢;微生物学;酵素学;突然変異または遺伝子工学)
要約【課題】低存在量の標的ポリヌクレオチドを検出する際の使用のための単純化された入手可能な手段を提供する。
【解決手段】本開示は、レア対立遺伝子バリアントなどの低頻度標的ポリヌクレオチドを検出する際の使用のための試薬、混合物、キット、および方法に関する。
【選択図】図1
特許請求の範囲【請求項１】
ａ）第１の標的ポリヌクレオチド鎖における第１の配列にハイブリダイズするように構成された第１のオリゴヌクレオチドであって、前記第１の配列が、標的バリアントヌクレオチドを含み、前記第１のオリゴヌクレオチドが、前記標的バリアントヌクレオチドにハイブリダイズするように配置されているその３’末端のヌクレオチド残基をさらに有する、第１のオリゴヌクレオチドと、
ｂ）前記第１の標的ポリヌクレオチド鎖内の第２の配列に相補的な配列にハイブリダイズするように構成された配列を有する第２のオリゴヌクレオチドであって、前記第１の標的ポリヌクレオチド鎖の前記第２の配列が、前記第１の標的ポリヌクレオチド鎖の前記第１の配列から５’上流に位置している、第２のオリゴヌクレオチドと、を含む、混合物。
続きを表示（約 1,200 文字）【請求項２】
ｃ）前記第１の標的ポリヌクレオチド鎖内の第３の配列に相補的な配列にハイブリダイズするように構成された配列を有する第３のオリゴヌクレオチドであって、前記第１の標的ポリヌクレオチド鎖の前記第３の配列が、前記第１の標的ポリヌクレオチド鎖の前記第１の配列と少なくとも部分的に重複し、前記第３の配列が、前記標的バリアントヌクレオチドを含む、第３のオリゴヌクレオチドをさらに含む、請求項１に記載の混合物。
【請求項３】
ａ）第１の標的ポリヌクレオチド鎖内に存在する第１の配列（Ａ）にハイブリダイズするように構成された第１のオリゴヌクレオチドであって、前記第１の配列が、標的バリアントヌクレオチド（「第１のバリアントヌクレオチド」）を含み、前記第１のオリゴヌクレオチドが、前記第１のバリアントヌクレオチドにハイブリダイズするように配置されているその３’末端のヌクレオチド残基をさらに有する、第１のオリゴヌクレオチドと、
ｂ）第２の配列（Ｂ）にハイブリダイズするように構成された第２のオリゴヌクレオチドであって、前記第２の配列が、第３の配列（Ｃ）に相補的であり、前記第３の配列が、前記第１の標的ポリヌクレオチド鎖内に存在し、前記第３の配列（Ｃ）が、前記第１の標的ポリヌクレオチド鎖の前記第１の配列（Ａ）から５’上流に位置している、第２のオリゴヌクレオチドと、を含む、混合物。
【請求項４】
ｃ）第５の配列（Ｅ）に相補的な第４の配列（Ｄ）にハイブリダイズするように構成された第３のオリゴヌクレオチドであって、前記第５の配列が、前記第１の標的ポリヌクレオチド鎖に存在し、前記第５の配列（Ｅ）が、前記第１の標的ポリヌクレオチド鎖における前記第１の配列（Ａ）と少なくとも部分的に重複し、前記第１の標的バリアントヌクレオチドを含む、第３のオリゴヌクレオチドをさらに含む、請求項２に記載の混合物。
【請求項５】
前記第３のオリゴヌクレオチドにおける前記標的バリアントヌクレオチドが、前記第３のオリゴヌクレオチドの３’末端または５’末端からの少なくとも２つのヌクレオチドである、請求項２または４に記載の混合物。
【請求項６】
前記第３のオリゴヌクレオチドが、検出可能な標識を含む、請求項２、４、および５のいずれか一項に記載の混合物。
【請求項７】
前記検出可能な標識が、蛍光標識である、請求項６に記載の混合物。
【請求項８】
前記検出可能な標識が、第１の末端ヌクレオチド上にある、請求項６または７に記載の混合物。
【請求項９】
前記第３のオリゴヌクレオチドが、消光部分をさらに含む、請求項６～８のいずれか一項に記載の混合物。
【請求項１０】
前記消光部分が、前記第３のオリゴヌクレオチドの第２の末端ヌクレオチド上にある、請求項９に記載の混合物。
（【請求項１１】以降は省略されています）
発明の詳細な説明【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１８年８月１６日に出願された、米国仮特許出願第６２／７１９，０７４号の優先権を主張し、その開示は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
続きを表示（約 16,000 文字）【０００２】
本開示は、標的ポリヌクレオチド、特に突然変異体または低存在量の標的ポリヌクレオチドを検出する際の使用のための試薬、混合物、キット、および方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
近年、癌の検出および治療は進歩している。この進歩の大部分は、我々が、癌の分子基盤および免疫系を回避するために癌細胞によって使用される詳細な分子メカニズムの理解を深めていることによるものである。よって、特定の癌治療に応答するであろう患者を特定するのに役立つバイオマーカーが特定されている。例えば、プログラム死リガンド１（ＰＤ－Ｌ１）などの腫瘍細胞に見られるバイオマーカーは、抗ＰＤ－１抗体などの免疫療法に応答するであろう患者を特定する。さらに、バイオマーカーには、特定の遺伝子における特異的な突然変異が含まれる。例えば、特定のキナーゼにおける突然変異の検出は、キナーゼ阻害剤の癌治療剤に応答する可能性がはるかに高い患者を特定するのに役立ち得る。次いで、癌がさらに突然変異して第１のキナーゼの遮断を克服すると、癌にこの第１のキナーゼを克服する能力を与える新しい突然変異の検出が、このタイプの癌に有効であり得る次の選択療法を特定するために、ここで使用され得る。
【０００４】
癌における突然変異を検出する能力は、低存在量の対立遺伝子を検出するための改善された方法を必要とする。腫瘍を構成する癌性細胞における不均一性のために、腫瘍の根底にある遺伝的欠陥を特定する場合、低存在量の対立遺伝子の検出が重要である。さらに、正常細胞からの循環ＤＮＡと比較して相対的に少量の循環腫瘍ＤＮＡの存在のために、癌患者の循環ＤＮＡの分析では低存在量の対立遺伝子の検出が重要である。両方の文脈において、そのような低存在量の対立遺伝子をより良好に検出する能力は、癌患者の改善された検出および改善された標的治療につながるはずである。現在利用可能なシステムは、非常に少ないコピー数（例えば、３０ｎｇの試験核酸試料において１０コピー未満および／または０．１％未満）で標的ポリヌクレオチド（例えば、突然変異体核酸配列を含む）を検出することができないか、または非常に費用がかかり、かつ／もしくは時間がかかり、複雑であるかのいずれかである。よって、当該技術分野では、低存在量の標的ポリヌクレオチドを検出する際の使用のための単純化された入手可能な試薬、混合物、キット、および方法が必要とされている。
【発明の概要】
【０００５】
低存在量の標的ポリヌクレオチドを検出する際の使用のための試薬、混合物、キット、および方法が本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、本開示は、ａ）第１の標的ポリヌクレオチド鎖（二本鎖ポリヌクレオチドにおける第１の鎖など）における第１の配列にハイブリダイズするように構成された第１のオリゴヌクレオチドであって、第１の標的ポリヌクレオチド鎖における第１の配列が、標的バリアントヌクレオチドを有し、第１のオリゴヌクレオチドが、標的バリアントヌクレオチドにハイブリダイズするように配置されているその３’末端のヌクレオチド残基をさらに有する、第１のオリゴヌクレオチドと、ｂ）第１の標的ポリヌクレオチド鎖の第２の配列に相補的な配列に（例えば、第１の鎖に相補的である第２の鎖の一部分に）ハイブリダイズするように構成された配列を有する第２のオリゴヌクレオチドであって、第１の標的ポリヌクレオチド鎖の第２の配列が、第１の標的ポリヌクレオチド鎖の第１の配列から５’上流に位置している、第２のオリゴヌクレオチドと、ｃ）第１の標的ポリヌクレオチド鎖の第３の配列に相補的な配列にハイブリダイズするように構成された配列を有する第３のオリゴヌクレオチドであって、第１の標的ポリヌクレオチド鎖の第３の配列が、第１の標的ポリヌクレオチド鎖および標的バリアントヌクレオチドの第１の配列と少なくとも部分的に重複する、第３のオリゴヌクレオチドと、を含む、混合物に関する。いくつかの実施形態では、追加のオリゴヌクレオチドおよび／またはオリゴヌクレオチドのセットも提供される。いくつかの実施形態では、第３のオリゴヌクレオチドは、検出可能である。そのような混合物を提供するために組み合わされる試薬もまた、それを含む、および／またはそれを使用するキットおよび方法と同様に、本明細書で企図される。本開示の態様および実施形態に関するさらなる詳細は、この特許出願全体を通して提供される。セクションおよびセクションヘッダーは、方法、組成物、およびキットまたはその中の機能要素の組み合わせを限定することを意図しない。
【図面の簡単な説明】
【０００６】
例示的な標的ポリヌクレオチドと整列させた例示的な第１のオリゴヌクレオチド（例えば、標的配列特異的プライマー（「ＴＳＰ」））、第２のオリゴヌクレオチド（例えば、遺伝子座特異的プライマー（「ＬＳＰ」））、および第３のオリゴヌクレオチド（例えば、標的部位特異的プローブ）。
富化サイクルあり（図２Ａ、２Ｂ、および２Ｃ）およびなし（図２Ｄ、２Ｅ、および２Ｆ）での、ＫＲＡＳＧ１２Ｒ（３４Ｇ＞Ｃ）標的ポリヌクレオチドの検出のための、例示的な標的配列特異的プライマー（ＴＳＰ）、および遺伝子座特異的プライマー（ＬＳＰ）を使用した標的ポリヌクレオチドの例示的な増幅。野生型ＤＮＡの試料（１０ｎｇ）またはスパイク試料（０．１％の対立遺伝子バリアントＤＮＡ（例えば、突然変異体ＤＮＡ）がスパイクされた１０ｎｇの野生型ＤＮＡ（ＣＥＰＨ個体１３４７－０２からの対照ＤＮＡ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃＣａｔ．Ｎｏ．４０３０６２、以下で「ＣＥＰＨ」と呼ばれる））は、３００ｎＭの各プライマー、２５０ｎＭのプローブ、１ｍＭのｄＮＴＰ、３９ｍＭのＴｒｉｓｐＨ８、２．５５ｍＭのＭｇＣｌ
2
、３０ｍＭのＫＣｌ、１６ｍＭの（ＮＨ
4
）
2
ＳＯ
4
、０．１ｍｇ／ｍｌのＢＳＡ、７％グリセロール、および０．０８５Ｕ／μＬのＰｌａｔｉｎｕｍＴａｑと組み合わせ、反応混合物を形成した。次に、混合物の１０μｌアリコートを９６ウェルプレートの４つの複製ウェルに播種した。ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ５Ｆ９６（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）上の各ウェルにおいてｑＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応は、富化フェーズあり（図２Ａ、２Ｂ、および２Ｃ）または富化フェーズなし（図２Ｄ、２Ｅ、および２Ｆ）で行った。
富化サイクルあり（図３Ａ、３Ｂ、および３Ｃ）およびなし（図３Ｄ、３Ｅ、および３Ｆ）での、ＫＲＡＳＧ１２Ａ（３５Ｇ＞Ｃ）標的ポリヌクレオチドについての、例示的な標的配列特異的プライマー（ＴＳＰ）、および遺伝子座特異的プライマー（ＬＳＰ）を使用した標的ポリヌクレオチドの例示的な増幅。野生型ＤＮＡの試料（１０ｎｇ）またはスパイク試料（０．１％の対立遺伝子バリアントＤＮＡ（例えば、突然変異体ＤＮＡ）がスパイクされた１０ｎｇの野生型（ＣＥＰＨ）ＤＮＡ）は、３００ｎＭの各プライマー、２５０ｎＭのプローブ、１ｍＭのｄＮＴＰ、３９ｍＭのＴｒｉｓｐＨ８、２．５５ｍＭのＭｇＣｌ
2
、３０ｍＭのＫＣｌ、１６ｍＭの（ＮＨ
4
）
2
ＳＯ
4
、０．１ｍｇ／ｍｌのＢＳＡ、７％グリセロール、および０．０８５Ｕ／μＬのＰｌａｔｉｎｕｍＴａｑと組み合わせ、反応混合物を形成した。次に、混合物の１０μｌアリコートを９６ウェルプレートの４つの複製ウェルに播種した。ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ５Ｆ９６（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）上の各ウェルにおいてｑＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応は、富化フェーズあり（図３Ａ、３Ｂ、および３Ｃ）または富化フェーズなし（図３Ｄ、３Ｅ、および３Ｆ）で行った。
野生型（ＣＥＰＨ）ＤＮＡおよび０．１％の以下の対立遺伝子バリアント（例えば、突然変異体）ＫＲＡＳＤＮＡ：ＫＲＡＳＧ１２Ｒ（３４Ｇ＞Ｃ、ＨｏｒｉｚｏｎＤｉｓｃｏｖｅｒｙＬｔｄ．Ｃａｔ．Ｎｏ．ＨＤ２８７）（図４Ａ）、ＫＲＡＳＧ１２Ａ（３５Ｇ＞Ｃ、ＨｏｒｉｚｏｎＤｉｓｃｏｖｅｒｙＬｔｄ．Ｃａｔ．Ｎｏ．ＨＤ２６５）（図４Ｂ）、ＫＲＡＳＧ１２Ｓ（３４Ｇ＞Ａ、ＨｏｒｉｚｏｎＤｉｓｃｏｖｅｒｙＬｔｄ．Ｃａｔ．Ｎｏ．ＨＤ２８８）（図４Ｃ）、ＫＲＡＳＧ１２Ｃ（３４Ｇ＞Ｔ、ＨｏｒｉｚｏｎＤｉｓｃｏｖｅｒｙＬｔｄ．Ｃａｔ．Ｎｏ．ＨＤ２６９）（図４Ｄ）、ＫＲＡＳＧ１２Ｄ（３５Ｇ＞Ａ、ＨｏｒｉｚｏｎＤｉｓｃｏｖｅｒｙＬｔｄ．Ｃａｔ．Ｎｏ．ＨＤ２７２）（図４Ｅ）、またはＫＲＡＳＧ１２Ｖ（３５Ｇ＞Ｔ、ＨｏｒｉｚｏｎＤｉｓｃｏｖｅｒｙＬｔｄ．Ｃａｔ．Ｎｏ．ＨＤ２８９）（図４Ｆ）で個別にスパイクされた野生型（ＣＥＰＨ）ＤＮＡの区別。ＰＣＲ条件は、富化ありで、図２および３について上記の通りであった。
図５Ａでは、突然変異体ＫＲＡＳＧ１３Ｄ（「Ｇ１３Ｄ」）標的ポリヌクレオチドと野生型（ＣＥＰＨ）核酸との間の区別は、最大６０ｍＭのＫＣｌ（塩化カリウム）および最大３０ｍＭの（ＮＨ
4
）
2
ＳＯ
4
（硫酸アンモニウム）を含むｑＰＣＲ反応において観察された。図５Ｂでは、突然変異体ＫＲＡＳＧ１３Ｄ標的ポリヌクレオチドと野生型（ＣＥＰＨ）核酸との間の区別は、ＫＣｌおよび（ＮＨ
4
）
2
ＳＯ
4
（硫酸アンモニウム）を欠くｑＰＣＲ反応において観察されなかった。野生型ＤＮＡは、両方の反応において０．２％の突然変異体ＫＲＡＳＧ１３Ｄ標的ポリヌクレオチドでスパイクした。
標的ポリヌクレオチドの増幅および検出に対する塩化カリウムおよび硫酸アンモニウムの効果。１０ｎｇの野生型（ＣＥＰＨ）ＤＮＡ、３００ｎＭの各プライマー（ＴＳＰおよびＬＳＰ）、２５０ｎＭのプローブ、１ｍｍのｄＮＴＰ、０．０８５Ｕ／ｕＬのＰｌａｔｉｎｕｍＴａｑ、２．５５ｍＭのＭｇＣｌ
2
、４５ｎＭのＲＯＸ受動的参照、３９ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ８、および７％グリセロールを含有する２０ｕＬの反応混合物を調製した。塩化カリウムおよび硫酸アンモニウムは、以下に記載されるように反応混合物に滴定した。図６Ａ：ＫＣｌまたは硫酸アンモニウムなし（区別なし）、図６Ｂ：３０ｍＭの硫酸アンモニウム、塩化カリウムなし（いくらか区別）、図６Ｃ：３０ｍＭのＫＣｌおよび３０ｍＭの硫酸アンモニウム（十分な区別）、ならびに図６Ｄ：６０ｍＭのＫＣｌおよび３０ｍＭの硫酸アンモニウム（抑制された反応）。Ｇ１３Ｄ突然変異体スパイクとの反応は、野生型（ＣＥＰＨ）ＤＮＡに０．２％でスパイクされた２０ｐｇのＫＲＡＳＧ１３Ｄ参照標準ＤＮＡ（ＨｏｒｉｚｏｎＤｉｓｃｏｖｅｒｙＬｔｄ．、Ｃａｔ．Ｎｏ．ＨＤ２９０）を含有した。以下の熱サイクリングプロトコル：９５℃（３分）、９５℃（３秒）／６４℃（２０秒）１９サイクル（富化フェーズ）、次いで９５℃（３秒）／６０℃（２０秒）４０サイクル（増幅および検出フェーズ）を使用して、ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ７装置で反応を増幅した。
図６において上記の通りのｑＰＣＲ条件（野生型ＤＮＡにスパイクされた０．１５％の突然変異体ＤＮＡを含む）を使用するが、示された濃度のＫＣｌおよび硫酸アンモニウムを含む中間濃度の試験。図７Ａは、４５ｍＭのＫＣｌおよび３０ｍＭの硫酸アンモニウムを含んだ。図７Ｂは、４５ｍＭのＫＣｌおよび２２ｍＭの硫酸アンモニウムを含んだ。
第３のオリゴヌクレオチド（例えば、標的部位特異的プローブ）の末端からの標的可変ヌクレオチドの距離の効果。実験は、１ｍＭのｄＮＴＰ、４５ｍＭのＫＣｌ、２２ｍＭの硫酸アンモニウム、０．０８５Ｕ／μＬのＰｌａｔｉｎｕｍＴａｑ、２．５５ｍＭのＭｇＣｌ
2
、４５ｎＭのＲＯＸ受動的参照、３９ｍＭのＴｒｉｓｐＨ８、および７％グリセロール、３００ｎＭの各プライマー（ＴＳＰおよびＬＳＰ）、２５０ｎＭのプローブ１、２、または３のうちの１つ、１０ｎｇの野生型（ＣＥＰＨ）ＤＮＡ、および１０ｐｇのＥＧＦＲＬ８５８Ｒ参照標準ＤＮＡ（ＨｏｒｉｚｏｎＤｉｓｃｏｖｅｒｙＬｔｄ．、Ｃａｔ．Ｎｏ．ＨＤ２５４）を含有する２０μＬの反応において実施した。示されるデータは、プローブの３’末端から３（プローブ１）、４（プローブ２）、または５（プローブ３）ヌクレオチドに位置している標的バリアントヌクレオチドで効果的な増幅およびリアルタイム検出が達成されたことを示す。
野生型ＤＮＡにスパイクされた突然変異体標的ＤＮＡの滴定およびその区別。これらの実験は、１０ｎｇの野生型（ＣＥＰＨ）ＤＮＡ、１ｍＭのｄＮＴＰ、４５ｍＭのＫＣｌ、２２ｍＭの硫酸アンモニウム、０．０８５Ｕ／μＬのＰｌａｔｉｎｕｍＴａｑ、２．５５ｍＭのＭｇＣｌ
2
、４５ｎＭのＲＯＸ受動的参照、３９ｍＭのＴｒｉｓｐＨ８、および７％グリセロールを含有する２０μＬの反応において行った。示された点突然変異を含有する人工突然変異体テンプレートの５０ｆＭ溶液を、まず３０００コピー／ｕＬに、次いで２５０コピー／ｕＬに希釈し、次いで２倍希釈を２コピー／ｕＬまで行った。以下の熱サイクリングプロトコル：９５℃（３分）、９５℃（３秒）／６４℃（２０秒）１９サイクル（富化フェーズ）、次いで９５℃（３秒）／６０℃（２０秒）４０サイクルを使用して、ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ７装置で反応を増幅した。実験は、以下の量およびコピーのプライマーおよび標的ポリヌクレオチドを使用して行った。図９Ａは、３００ｎＭの各プライマーおよび２５０コピーの標的ポリヌクレオチドを含み、図９Ｂは、３００ｎＭの各プライマーおよび１６コピーの標的ポリヌクレオチドを含み、図９Ｃは、３００ｎＭの各プライマーおよび２コピーの標的ポリヌクレオチドを含み、図９Ｄは、４５０ｎＭの各プライマーおよび２５０コピーの標的ポリヌクレオチドを含み、図９Ｅは、４５０ｎＭの各プライマーおよび１６コピーの標的ポリヌクレオチドを含み、図９Ｆは、４５０ｎＭの各プライマーおよび２コピーの標的ポリヌクレオチドを含んだ。
突然変異体ＤＮＡの野生型ＤＮＡへの滴定。これらの実験は、図９Ａ～９Ｆについて記載される通り、１０ｎｇの野生型（ＣＥＰＨ）ＤＮＡ、１ｍＭのｄＮＴＰ、４５ｍＭのＫＣｌ、２２ｍＭの硫酸アンモニウム、０．０８５Ｕ／μＬのＰｌａｔｉｎｕｍＴａｑ、２．５５ｍＭのＭｇＣｌ
2
、４５ｎＭのＲＯＸ受動的参照、３９ｍＭのＴｒｉｓｐＨ８、および７％グリセロールを含有する２０μＬの反応を使用して行った。人工突然変異体テンプレートの５０ｆＭ溶液は、まず３０００コピー／ｕＬに、次いで２５０コピー／ｕＬに希釈し、次いで２倍希釈を２コピー／ｕＬまで行った。以下の熱サイクリングプロトコル：９５℃（３分）、９５℃（３秒）／６４℃（２０秒）１９サイクル（富化フェーズ）、次いで９５℃（３秒）／６０℃（２０秒）４０サイクルを使用して、ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ７装置で反応を増幅した。反応にスパイクされた各プライマーの量およびバリアント対立遺伝子（例えば、突然変異体）ポリヌクレオチドのコピーは、示される通りであった。左側ｙ軸は、ＦＡＭのＣｑを示す。右側軸は、ＦＡＭ－ＶＩＣのデルタＣｑを示す。
３０００、３００、３０、および３コピーの標的ポリヌクレオチド（ＮＲＡＳＱ６１Ｒ）の示された数の希釈を野生型ＤＮＡにスパイクした。これらの実験では、３００ｎＭの各プライマー（ＴＳＰおよびＬＳＰ）、２５０ｎＭのプローブ、１０ｎｇの野生型（ＣＥＰＨ）ＤＮＡ、および示された量の突然変異体ＤＮＡ（ＨｏｒｉｚｏｎＤｉｓｃｏｖｅｒｙＬｔｄ．、Ｃａｔ．Ｎｏ．ＨＤ５７４）、１コピー未満、３コピー、３０コピー、３００コピー、または３０００コピー、１ｍＭのｄＮＴＰ、４５ｍＭのＫＣｌ、２２ｍＭの硫酸アンモニウム、０．０８５Ｕ／ｕＬのＰｌａｔｉｎｕｍＴａｑ、２．５５ｍＭのＭｇＣｌ
2
、４５ｎＭのＲＯＸ受動的参照、３９ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ８、および７％のグリセロールを含有する２０ｕＬの反応混合物を調製した。データはＥｘｃｅｌ形式でエクスポートし、複製反応についてのＣｑ値は平均化し、各条件における標的のデルタ平均Ｃｑは決定、プロットした（データは図示しない）。デルタＣｑは、定量化方法として使用した。ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ７の熱サイクリング条件は、９５℃（３分）、富化フェーズ－９５℃（３秒）／６４℃（２０秒）の１９サイクル、増幅－９５℃（３秒）／６０℃（２０秒）の４０サイクルであった。「ｎｔｃ」＝テンプレートコントロールなし。
標的ポリヌクレオチド（ＮＲＡＳＱ６１Ｋ）の示されたコピー数（２、４、８、１６、３１、６２、１２５、または２５０コピー）の希釈を野生型ＤＮＡにスパイクした。これらの実験では、３００ｎＭの各プライマー（ＴＳＰおよびＬＳＰ）、２５０ｎＭのプローブ、１０ｎｇの野生型（ＣＥＰＨ）ＤＮＡ、および示された量の突然変異体（ＨｏｒｉｚｏｎＤｉｓｃｏｖｅｒｙＬｔｄ．、Ｃａｔ．Ｎｏ．ＨＤ３５１）、２、４、８、１６、３１、６２．５、１２５、または２５０コピー、１ｍＭのｄＮＴＰ、４５ｍＭのＫＣｌ、２２ｍＭの硫酸アンモニウム、０．０８５Ｕ／ｕＬのＰｌａｔｉｎｕｍＴａｑ、２．５５ｍＭのＭｇＣｌ
2
、４５ｎＭのＲＯＸ受動的参照、３９ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ８、および７％のグリセロールを含有する２０ｕＬの反応混合物を調製した。データはＥｘｃｅｌ形式でエクスポートし、複製反応についてのＣｑ値は平均化し、各条件における標的のデルタ平均Ｃｑは決定、プロットした（データは図示しない）。デルタＣｑは、定量化方法として使用した。ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ７の熱サイクリング条件は、９５℃（３分）、９５℃（３秒）／６４℃（２０秒）の１９サイクル、９５℃（３秒）／６０℃（２０秒）の４０サイクルであった。
標的ポリヌクレオチド（ＫＲＡＳＧ１２Ｒ）の３コピーの、２０ｎｇ（０．０５％スパイクイン、図１３Ａ）、１０ｎｇ（０．１％スパイクイン、図１３Ｂ）、および５ｎｇ（０．２％スパイクイン、図１３Ｃ）野生型ＤＮＡへの希釈。これらの実験は、３００ｎＭのＫＲＡＳ順方向および逆方向プライマー、１００ｎＭのＲＰＰＨ１順方向および逆方向プライマー、２５０ｎＭのＫＲＡＳ－ＦＡＭプローブ、１５０ｎＭのＲＰＰＨ１－ＶＩＣプローブ、１ｍＭのｄＮＴＰ、４５ｍＭのＫＣｌ、２２ｍＭの硫酸アンモニウム、０．０８５Ｕ／ｕＬのＰｌａｔｉｎｕｍＴａｑ、２．５５ｍＭのＭｇＣｌ
2
、４５ｎＭのＲＯＸ受動的参照、３９ｍＭのＴｒｉｓｐＨ８、７％グリセロールを含有する反応混合物において実施した。１０ｐｇのＫＲＡＳＧ１２Ｒ参照標準ＤＮＡ（ＨｏｒｉｚｏｎＤｉｓｃｏｖｅｒｙＬｔｄ．、Ｃａｔ．Ｎｏ．ＨＤ２８７）、示された量の野生型（ＣＥＰＨ）ＤＮＡを調製した。以下の熱サイクリングプロトコル：９５℃（２分）、９５℃（１秒）／６４℃（２０秒）１９サイクル（富化）、次いで９５℃（１秒）／６０℃（２０秒）４０サイクルを使用して、ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ５で反応を実行した。
標的ポリヌクレオチドの増幅における逆方向ＫＲＡＳＧ１２Ｄ（３５Ｇ＞Ａ）プライマーの使用。これらの実験は、１０ｎｇの野生型（ＣＥＰＨ）ＤＮＡ、３００ｎＭの示されたＫＲＡＳ順方向および逆方向プライマー、２５０ｎＭのＫＲＡＳプローブを含有する２０ｕＬの反応混合物において実施し、突然変異体ＫＲＡＳ（示されるように、Ｇ１２ＤまたはＧ１２Ｓ）参照標準ＤＮＡの１０ｐｇのスパイク（ＨｏｒｉｚｏｎＤｉｓｃｏｖｅｒｙＬｔｄ．、それぞれ、Ｃａｔ．Ｎｏ．ＨＤ２７２またはＨＤ２８８）を利用し、１ｍＭのｄＮＴＰ、４５ｍＭのＫＣｌ、２２ｍＭの硫酸アンモニウム、０．０８５Ｕ／ｕＬのＰｌａｔｉｎｕｍＴａｑ、２．５５ｍＭのＭｇＣｌ
2
、４５ｎＭのＲＯＸ受動的参照、３９ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ８、および７％のグリセロールを調製した。熱サイクリング条件は、９５℃（３分）、９５℃（３秒）、６４℃（２０秒）（富化）の１９サイクル、続いて９５℃（３秒）／６０℃（２０秒）の４０サイクルであった。
図１４について記載されるように実施されるが、代わりにＫＲＡＳＧ１２Ｓ（３４Ｇ＞Ａ）の逆方向プライマーを使用する、標的ポリヌクレオチドの増幅における逆方向ＫＲＡＳＧ１２Ｓ（３４Ｇ＞Ａ）プライマーの使用。
野生型ＤＮＡの存在下での標的ポリヌクレオチド（０．１％突然変異体標的ポリヌクレオチド）の増幅。図１６Ａ．ＥＧＦＲ２０Ｔ７９０Ｍ（２３６９Ｃ＞Ｔ、ＨｏｒｉｚｏｎＤｉｓｃｏｖｅｒｙＬｔｄ．、Ｃａｔ．Ｎｏ．ＨＤ２５８）標的ポリヌクレオチド。図１６Ｂ．ＥＧＦＲ１９（ｄｅｌ７４６－７５０、ＨｏｒｉｚｏｎＤｉｓｃｏｖｅｒｙＬｔｄ．、Ｃａｔ．Ｎｏ．ＨＤ２５１）標的ポリヌクレオチド。図１６Ｃ．ＮＲＡＳＧ１２Ｄ（３５Ｇ＞Ａ、ＨｏｒｉｚｏｎＤｉｓｃｏｖｅｒｙＬｔｄ．、Ｃａｔ．Ｎｏ．ＨＤ７４５）標的ポリヌクレオチド。図１６Ｄ．ＢＲＡＦＶ６００Ｅ（１７９９Ｔ＞Ａ、ＨｏｒｉｚｏｎＤｉｓｃｏｖｅｒｙＬｔｄ．、Ｃａｔ．Ｎｏ．ＨＤ２３８）標的ポリヌクレオチド。図１６Ｅ．ＮＲＡＳＧ１３Ｄ（３８Ｇ＞Ａ、ＨｏｒｉｚｏｎＤｉｓｃｏｖｅｒｙＬｔｄ．、Ｃａｔ．Ｎｏ．ＨＤ７４５）標的ポリヌクレオチド。図１６Ｆ．ＥＧＦＲＬ８６１Ｑ（２５８２Ｔ＞Ａ、ＨｏｒｉｚｏｎＤｉｓｃｏｖｅｒｙＬｔｄ．、Ｃａｔ．Ｎｏ．ＨＤ２５７）標的ポリヌクレオチド。実験の各々は、１０ｎｇの野生型（ＣＥＰＨ）ＤＮＡ、各々３００ｎＭの第１および第２のオリゴヌクレオチド（例えば、標的配列特異的プライマー（ＴＳＰ）および遺伝子座特異的プライマー（ＬＳＰ））、２５０ｎＭのプローブを含有する２０ｕＬの反応混合物において実施し、上記で列挙される対応する突然変異体ＤＮＡの１０ｐｇのスパイクを利用し（ＨｏｒｉｚｏｎＤｉｓｃｏｖｅｒｙＬｔｄ．、ＲｅｆｅｒｅｎｃｅＳｔａｎｄａｒｄｓ）、１ｍＭのｄＮＴＰ、４５ｍＭのＫＣｌ、２２ｍＭの硫酸アンモニウム、０．０８５Ｕ／ｕＬのＰｌａｔｉｎｕｍＴａｑ、２．５５ｍＭのＭｇＣｌ
2
、４５ｎＭのＲＯＸ受動的参照、３９ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ８、および７％のグリセロールを調製した。データはＥｘｃｅｌ形式でエクスポートし、複製反応についてのＣｑ値は平均化し、各条件における標的のデルタ平均Ｃｑは決定、プロットした（データは図示しない）。デルタＣｑは、定量化方法として使用した。使用された熱サイクリング条件は、９５℃（３分）、９５℃（３秒）／６４℃（２０秒）の１９サイクル（富化）、続いて９５℃（３秒）／６０℃（２０秒）の４０サイクルであった。
異なる長さのプローブを使用した標的ポリヌクレオチドの増幅。図１７Ａ．ＮＲＡＳＱ６１Ｌ（１８２Ａ＞Ｔ）、１６および２１ヌクレオチドプローブ。図１７Ｂ．ＮＲＡＳＱ６１Ｈ（１８３Ａ＞Ｔ）、１５および２０ヌクレオチドプローブ。これらの実験は、３００ｎＭの各プライマー、２５０ｎＭの対応するプローブ、１０ｎｇの野生型（ＣＥＰＨ）ＤＮＡを含有する２０ｕＬの反応混合物において実施し、２０ｐｇＮＲＡＳＱ６１ＬまたはＱ６１Ｈ参照標準ＤＮＡの突然変異体スパイク（ＨｏｒｉｚｏｎＤｉｓｃｏｖｅｒｙＬｔｄ．、それぞれ、Ｃａｔ．Ｎｏ．ＨＤ４１２またはＨＤ３０３）が含まれ、１ｍＭのｄＮＴＰ、４５ｍＭのＫＣｌ、２２ｍＭの硫酸アンモニウム、０．０８５Ｕ／ｕＬのＰｌａｔｉｎｕｍＴａｑ、２．５５ｍＭのＭｇＣｌ
2
、４５ｎＭのＲＯＸ受動的参照、３９ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ８、および７％のグリセロールを調製した。以下の熱プロトコルを使用して、ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ５上で反応を実行した：９５℃（２分）、９５℃（１秒）／６４℃（２０秒）で１９サイクル（富化）、次いで９５℃（１秒）／６０℃（２０秒）で４０サイクル。
野生型（ＣＥＰＨ）ＤＮＡの存在下での標的ポリヌクレオチド（０．１％突然変異体標的ポリヌクレオチド）の増幅。図１８Ａ．ＥＳＲ１Ｅ３８０Ｑ（１１３８Ｇ＞Ｃ）標的ポリヌクレオチド。図１８Ｂ．ＰＩＫ３ＣＡＨ１０４７Ｒ（３１４０Ａ＞Ｇ）標的ポリヌクレオチド。図１８Ｃ．ＴＰ５３Ｈ１７９Ｑ（５３７Ｔ＞Ａ）標的ポリヌクレオチド。実験の各々は、１０ｎｇの野生型（ＣＥＰＨ）ＤＮＡ、各々３００ｎＭの第１および第２のオリゴヌクレオチド（例えば、示された突然変異体標的およびＲＰＰＨ１対照標的の各々についての標的配列特異的プライマー（ＴＳＰ）および遺伝子座特異的プライマー（ＬＳＰ））、示された突然変異体標的およびＲＰＰＨ１対照標的の各々についての２５０ｎＭのプローブを含有する２０ｕＬの反応混合物において実施し、上記で列挙される対応する突然変異体ＤＮＡの１０ｐｇのスパイクを利用し、１ｍＭのｄＮＴＰ、４５ｍＭのＫＣｌ、２２ｍＭの硫酸アンモニウム、０．０８５Ｕ／ｕＬのＰｌａｔｉｎｕｍＴａｑ、２．５５ｍＭのＭｇＣｌ
2
、４５ｎＭのＲＯＸ受動的参照、３９ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ８、および７％のグリセロールを調製した。データはＥｘｃｅｌ形式でエクスポートし、複製反応についてのＣｑ値は平均化し、各反応条件における標的のデルタ平均Ｃｑは決定、プロットした（データは図示しない）。ＲＰＰＨ１対照標的と各個々の突然変異体標的との間のデルタＣｑは、定量化方法として使用した。使用された熱サイクリング条件は、９５℃（３分）、９５℃（３秒）／６４℃（２０秒）の１９サイクル（富化）、続いて９５℃（３秒）／６０℃（２０秒）の４０サイクルであった。
野生型（ＣＥＰＨ）ＤＮＡの存在下での標的ポリヌクレオチド（０．１％突然変異体標的ポリヌクレオチド）の増幅。図１９Ａ．ＴＰ５３Ｙ２２０Ｃ（６５９Ａ＞Ｇ）標的ポリヌクレオチド。図１９Ｂ．ＴＰ５３Ｒ２４９Ｍ（７４６Ｇ＞Ｔ）標的ポリヌクレオチド。実験の各々は、１０ｎｇの野生型（ＣＥＰＨ）ＤＮＡ、各々３００ｎＭの第１および第２のオリゴヌクレオチド（例えば、示された突然変異体標的およびＲＰＰＨ１対照標的の各々についての標的配列特異的プライマー（ＴＳＰ）および遺伝子座特異的プライマー（ＬＳＰ））、示された突然変異体標的およびＲＰＰＨ１対照標的の各々についての２５０ｎＭのプローブを含有する２０ｕＬの反応混合物において実施し、上記で列挙される対応する突然変異体ＤＮＡの１０ｐｇのスパイクを利用し、１ｍＭのｄＮＴＰ、４５ｍＭのＫＣｌ、２２ｍＭの硫酸アンモニウム、０．０８５Ｕ／ｕＬのＰｌａｔｉｎｕｍＴａｑ、２．５５ｍＭのＭｇＣｌ
2
、４５ｎＭのＲＯＸ受動的参照、３９ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ８、および７％のグリセロールを調製した。データはＥｘｃｅｌ形式でエクスポートし、複製反応についてのＣｑ値は平均化し、各反応条件における標的のデルタ平均Ｃｑは決定、プロットした（データは図示しない）。ＲＰＰＨ１対照標的と各個々の突然変異体標的との間のデルタＣｑは、定量化方法として使用した。使用された熱サイクリング条件は、９５℃（３分）、９５℃（３秒）／６４℃（２０秒）の１９サイクル（富化）、続いて９５℃（３秒）／６０℃（２０秒）の４０サイクルであった。
例示的な野生型ＥＧＦＲおよびＢＲＡＦ配列。太字のヌクレオチドは、本明細書の他の場所に記載される突然変異体ポリヌクレオチドにおいて突然変異している塩基を表す。
例示的な野生型ＫＲＡＳおよびＮＲＡＳ配列。太字のヌクレオチドは、本明細書の他の場所に記載される突然変異体ポリヌクレオチド（例えば、ＫＲＡＳｃ．３４Ｇ、ｃ．３５Ｇ、ｃ．３８Ｇ）において突然変異している塩基を表す。
【０００７】
定義
本明細書で使用される場合、「マイナー対立遺伝子」または「マイナー対立遺伝子バリアント」という用語は、代替対立遺伝子バリアント（例えば、「メジャー対立遺伝子」および／または「野生型対立遺伝子」などの「豊富な対立遺伝子」）と比較して、試料中により低レベルで存在する標的ポリヌクレオチドを指す。例えば、マイナー対立遺伝子バリアントは、所与の一塩基多型（ＳＮＰ）または遺伝子についての別の対立遺伝子バリアントと比較して、１／１０、１／１００、１／１，０００、１／１０，０００、１／１００，０００、１／１，０００，０００、１／１０，０００，０００、１／１００，０００，０００、または１／１，０００，０００，０００未満の頻度で見られ得る（例えば、そのマイナー対立遺伝子頻度（「ＭＡＦ」）を有する）。あるいは、レア対立遺伝子バリアントは、例えば、試料または反応体積の１、１０、１００、１，０００マイクロリットルあたり２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、５０、７５、１００、２５０、５００、７５０、１，０００、２，５００、５，０００、７，５００、１０，０００、２５，０００、５０，０００、７５，０００、１００，０００、２５０，０００、５００，０００、７５０，０００、または１，０００，０００コピー未満であり得る。いくつかの実施形態では、所与のＳＮＰまたは遺伝子の別の対立遺伝子バリアントと比較して１，０００コピーにおいて１以下の頻度で存在する対立遺伝子は、本明細書において「レア対立遺伝子」、「レア対立遺伝子バリアント」、「低存在量の対立遺伝子」、または「低存在量の対立遺伝子バリアント」を指すことができる。当業者は、本明細書で明示的に定義されるもの以外のマイナー対立遺伝子またはマイナー対立遺伝子バリアントが本開示に適用可能であることを理解するであろう。
【０００８】
本明細書で使用される場合、「豊富な対立遺伝子」という用語は、代替対立遺伝子バリアントと比較して、試料中により高レベルで存在する標的ポリヌクレオチドを指す。豊富な対立遺伝子は、「メジャー対立遺伝子」および／または「野生型対立遺伝子」とも呼ばれ得る。例えば、豊富な対立遺伝子は、所与のＳＮＰもしくは遺伝子についての対立遺伝子バリアント、および／またはメジャー対立遺伝子（もしくは野生型対立遺伝子）と比較して、１０ｘ、１００ｘ、１，０００ｘ、１０，０００ｘ、１００，０００ｘ、１，０００，０００ｘ、１０，０００，０００ｘ、１００，０００，０００ｘ、または１，０００，０００，０００ｘを超える頻度で見られ得る。あるいは、豊富な対立遺伝子バリアントは、例えば、試料または反応体積の１、１０、１００、１，０００マイクロリットルあたり２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、５０、７５、１００、２５０、５００、７５０、１，０００、２，５００、５，０００、７，５００、１０，０００、２５，０００、５０，０００、７５，０００、１００，０００、２５０，０００、５００，０００、７５０，０００、１，０００，０００コピー超で存在し得る。当業者は、本明細書で明示的に定義されるもの以外の豊富な対立遺伝子が本開示に適用可能であることを理解するであろう。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
本開示は、低存在量（または「レア」）標的ポリヌクレオチドなどの１つ以上の標的ポリヌクレオチド（あるいは、本明細書では標的ポリヌクレオチドおよび／または標的ポリヌクレオチド配列と呼ばれ得る）を検出する際の使用のための試薬、混合物、キット、および方法に関し、少なくとも１つの標的バリアントヌクレオチドについての特異性を有する標的配列特異的プライマー（「ＴＳＰ」と略されることもある）として機能する少なくとも第１のオリゴヌクレオチド、標的バリアントヌクレオチドではなく、標的ポリヌクレオチドについての特異性を有するプライマーとして機能する少なくとも１つの第２のオリゴヌクレオチド（遺伝子座特異的プライマー（「ＬＳＰ」）と呼ばれることもある）、および少なくとも１つの標的バリアントヌクレオチドを含む標的ポリヌクレオチド配列についての結合特異性を有する標的部位特異的プローブとして機能し、検出可能な特性（例えば、検出可能な標識）を含むことができる、少なくとも第３のオリゴヌクレオチドを使用する、少なくとも１つの標的バリアントヌクレオチド（例えば、突然変異された遺伝子バリアントおよび／またはマイナー／特定の対立遺伝子バリアント）を含む。いくつかの例示的な実施形態では、本開示は、豊富な代替核酸配列（例えば、非突然変異、「野生型」、またはメジャー対立遺伝子バリアント）を含む試料（例えば、混合物）内からの低存在量の標的ポリヌクレオチドを増幅する増幅反応において第１、第２、および第３のオリゴヌクレオチドを使用する試薬、キット、および方法に関する。いくつかの実施形態では、低存在量の標的ポリヌクレオチドは、検出可能なオリゴヌクレオチド（例えば、第３のオリゴヌクレオチドなどの標的部位特異的プローブ）の検出可能な特性における変化を検出することによって特定され得る。第１、第２、および第３のオリゴヌクレオチドを含む各混合物は、典型的には、特定の標的バリアントヌクレオチドを含む（またはそれに相補的である）特定の標的ポリヌクレオチド配列を含むか、またはそれに相補的である、核酸配列についての結合特異性を有する１つのタイプの第３のオリゴヌクレオチド（例えば、標的部位特異的プローブ）のみを含むことができる。しかしながら、いくつかの実施形態では、混合物は、異なる標的配列特異的プライマー、遺伝子座特異的プライマー、および／または標的部位特異的プローブ（例えば、マルチプレックス反応など）を含むことができる。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチド（すなわち、プライマーおよびプローブ）、および／またはその混合物を使用して、より豊富な「野生型」核酸（例えば、非突然変異核酸、またはメジャー対立遺伝子を表す核酸（例えば、「メジャー対立遺伝子」または「メジャー対立遺伝子バリアント」）の存在下で、少量の、例えば、３コピー以下の１つ以上の低存在量の標的ポリヌクレオチド（複数可）（例えば、レア標的ポリヌクレオチド）を検出することができる。例示的な例では、混合物は、例えば、約１０ｐｇの低存在量（または「レア」）標的ポリヌクレオチドおよび約１０ｎｇのゲノムＤＮＡ、または約０．１％の低存在量（もしくは「レア」）標的ポリヌクレオチドを含み得る。他の実施形態、変形などは、本明細書で企図され、本開示から当業者によって理解されるであろう。
【００１０】
標的バリアントヌクレオチド
標的バリアントヌクレオチドは、核酸配列の異なるバージョン間で変化する標的ポリヌクレオチド配列内のヌクレオチド残基である（例えば、特定の突然変異体および／または対立遺伝子に対応する遺伝子および／またはコード配列）。いくつかの実施形態では、標的バリアントヌクレオチドは、対立遺伝子（すなわち、対立遺伝子バリアント）に「対応する」、関連する、および／またはその内に見られると言われ、それは、本開示の目的のために、遺伝子のコード配列、または遺伝子の非コード配列内に見られるか、またはそれらに関連し得る、特定の遺伝子の２つ以上のバリアント間のＤＮＡ配列の相違を表す。標的バリアントヌクレオチドは、メジャー対立遺伝子またはマイナー対立遺伝子に対応することができ、そのようなマイナー対立遺伝子は、それを低存在量の対立遺伝子またはレア対立遺伝子として認める頻度で見られ得る。いくつかの実施形態では、標的バリアントヌクレオチドは、より大きな対立遺伝子配列の相違の一部である。ヒトでは、個体のゲノム内の特定の対立遺伝子の存在は、例えば、目の色などの変化をもたらし得るが、特定の疾患状態にも関連または相関し得る。植物などの非哺乳動物では、ゲノムにおける特定の対立遺伝子の存在を使用して、例えば、特定の植物種、サブタイプ、および／または遺伝子型を特定することができる。標的バリアントヌクレオチドはまた、遺伝的、確率的（すなわち、ランダム）、または他の突然変異の結果として、標的ポリヌクレオチド内に存在し得る。標的バリアントヌクレオチドを含む例示的な突然変異は、例えば、異常な状態（例えば、疾患）をもたらす別のものについての「正常な」ヌクレオチドの置換、挿入、または欠失から生じる、点または他の突然変異を含む核酸配列を含み得る。いくつかの実施形態では、標的バリアントヌクレオチドは、核酸配列の集団において、１／１０、１／１００、１／１，０００、１／１０，０００、１／１００，０００、１／１，０００，０００、１／１０，０００，０００、１／１００，０００，０００、または１／１，０００，０００，０００、およびその間の任意の分画範囲未満の頻度で存在する対立遺伝子バリアントに対応し得る。例えば、いくつかの実施形態では、標的バリアントヌクレオチドは、試料核酸集団の約１％、０．１％、０．０１％、０．００１％、または０．０００１％のいずれか未満の集団頻度を有するマイナー対立遺伝子配列の同一性に対応する（すなわち、「集団頻度」は、試料がマイナー対立遺伝子を含む場合、ヘテロ接合型個体では５０％優勢であり得るため、ここでは「試料集団」を優先して参照される）。特定の実施形態では、標的対立遺伝子は、レア対立遺伝子または低存在量の対立遺伝子である。
（【００１１】以降は省略されています）

関連特許