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公開番号2025036661
公報種別公開特許公報(A)
公開日2025-03-14
出願番号2024231243,2021534071
出願日2024-12-26,2020-07-22
発明の名称抗体酵素の革新的製造技術
出願人国立研究開発法人科学技術振興機構
代理人個人,個人,個人,個人
主分類C07K 16/00 20060101AFI20250306BHJP(有機化学)
要約【課題】保存安定性に優れる当該抗体酵素を安定的に製造する方法を提供する。
【解決手段】抗体κ型軽鎖をコードするポリヌクレオチドを含む発現用ベクターを用いて、細胞内又は細胞外発現系によって、前記抗体κ型軽鎖を発現させ、得られた発現産物から、第1の充填剤を含むカラムを用いたカラムクロマトグラフィー法により、前記抗体κ型軽鎖を含む粗精製物を得、前記抗体κ型軽鎖を含む粗精製物に金属イオンを添加し、前記抗体κ型軽鎖と前記金属イオンとが結合した抗体κ型軽鎖複合体を含む粗精製物を得、前記抗体κ型軽鎖複合体を含む粗精製物から、第2の充填剤を含むカラムを用いたカラムクロマトグラフィー法により、前記抗体κ型軽鎖複合体の精製物を得、前記抗体κ型軽鎖複合体の精製物から前記金属イオンを除去して抗体κ型軽鎖の精製物を得る、抗体κ型軽鎖の製造方法。
【選択図】なし
特許請求の範囲【請求項１】
抗体κ型軽鎖をコードするポリヌクレオチドを含む発現用ベクターを用いて、細胞内又は細胞外発現系によって、前記抗体κ型軽鎖を発現させる発現工程と、
前記発現工程で得られた発現産物から、第１の充填剤を含むカラムを用いたカラムクロマトグラフィー法により、前記抗体κ型軽鎖を含む粗精製物を得る第１の精製工程と、
前記抗体κ型軽鎖を含む粗精製物に金属イオンを添加し、前記抗体κ型軽鎖と前記金属イオンとが結合した抗体κ型軽鎖複合体を含む粗精製物を得る添加工程と、
前記添加工程後の前記抗体κ型軽鎖複合体を含む粗精製物から、第２の充填剤を含むカラムを用いたカラムクロマトグラフィー法により、前記抗体κ型軽鎖複合体の精製物を得る第２の精製工程と、
前記第２の精製工程後の前記抗体κ型軽鎖複合体の精製物から前記金属イオンを除去して抗体κ型軽鎖の精製物を得る除去工程と、
を含む、抗体κ型軽鎖の製造方法。
続きを表示（約 790 文字）【請求項２】
前記除去工程をキレート剤の添加により行う、請求項１に記載の抗体κ型軽鎖の製造方法。
【請求項３】
前記金属イオンが銅イオン、ニッケルイオン、亜鉛イオン、金イオン、銀イオン、及び白金イオンからなる群より選択される１種以上である、請求項１又は２に記載の抗体κ型軽鎖の製造方法。
【請求項４】
前記抗体κ型軽鎖は、可変領域が、カバット分類で可変領域のＮ末端から９５番目のアミノ酸残基が、欠失している又はプロリン残基以外のアミノ酸残基であるアミノ酸配列からなるポリペプチドである、請求項１～３のいずれか一項に記載の抗体κ型軽鎖の製造方法。
【請求項５】
前記発現工程前に、可変領域が、カバット分類で可変領域のＮ末端から９５番目のアミノ酸残基が、プロリン残基であるアミノ酸配列からなるポリペプチドである抗体κ型軽鎖をコードするポリヌクレオチドについて、前記プロリン残基が欠失又は置換するように改変して、可変領域が、カバット分類で可変領域のＮ末端から９５番目のアミノ酸残基が、欠失している又はプロリン残基以外のアミノ酸残基であるアミノ酸配列からなるポリペプチドである抗体κ型軽鎖をコードするポリヌクレオチドを得る改変工程を更に含む、請求項４に記載の抗体κ型軽鎖の製造方法。
【請求項６】
酵素活性を有さない抗体κ型軽鎖に酵素活性を付与する、又は抗体κ型軽鎖の酵素活性を向上させる方法であって、
前記酵素活性を有さない抗体κ型軽鎖の可変領域が、カバット分類で可変領域のＮ末端から９５番目のアミノ酸残基がプロリン残基であるアミノ酸配列からなるポリペプチドであり、
前記酵素活性を有さない抗体κ型軽鎖をコードするポリヌクレオチドを、前記プロリン残基が欠失又は置換するように改変することを含む、方法。

発明の詳細な説明【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗体酵素の革新的製造技術に関する。具体的には、抗体κ型軽鎖に酵素活性を付与する又は抗体κ型軽鎖の酵素活性を向上させる製造方法に関する。本願は、２０１９年７月２４日に、日本に出願された特願２０１９－１３６４０３号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
続きを表示（約 6,100 文字）【背景技術】
【０００２】
抗体は、重鎖（Ｈ鎖：Heavy chain）及び軽鎖（Ｌ鎖：Light chain）から構成されている。重鎖及び軽鎖は、可変領域（ＶＲ：Variable Region）及び定常領域（ＣＲ：Constant Region）から構成されており、可変領域は、超可変領域（ＣＤＲ：Complimentarity Determining Region）を有している。さらに、抗体の軽鎖は、κ型及びλ型に分類される。
【０００３】
近年、酵素様活性をもつ抗体、即ち、抗体酵素が注目を集めている。抗体酵素は、抗体の高い分子認識能と酵素活性とを併せ持つため、医療、化学工業、食品工業等といった、多くの面で応用が期待されている。特に、標的分子への特異性が高く、かつ酵素活性によって標的分子に対する障害性を発揮し得る抗体酵素は、副作用の少ない優れた抗がん剤となることが期待される。特にヒト型の抗体酵素は、人体に投与した際の副作用が少ないと予想されるために、国内外の製薬会社などは、有用なヒト型の抗体酵素が開発されることを待ち望んでいる。
【０００４】
発明者らは、これまで、抗体酵素に関して種々の独創的な研究を行ってきている（例えば、特許文献１～４等参照）。
【０００５】
抗体酵素を医薬品として臨床上使用するためには、充分な活性を有する抗体酵素を安定して量産可能であることが重要である。しかしながら、多くの抗体酵素は、酵素活性が不十分であり、また、遺伝子組換え技術を用いて細胞内又は細胞外発現系によって人工的に合成した場合、性能が安定せず、ロット間の差が大きいという問題がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
日本国特開２００６－１９７９３０号公報
国際公開第２０１１／１０２５１７号
国際公開第２０１３／１３３２５３号
国際公開第２０１５／０２５７８６号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、より高酵素活性な抗体軽鎖からなる抗体酵素の製造方法、及び保存安定性に優れる当該抗体酵素を安定的に製造する方法を提供することを主たる目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
発明者らは、抗体κ軽鎖のアミノ酸配列中の、カバット分類で可変領域のＮ末端から９５番目のプロリン残基を欠失又は置換させることにより、酵素活性がより高い型抗体軽鎖が得られることを見出し、本発明を完成するに至った。また、本発明者らは、抗体軽鎖の製造時の精製工程において、抗体軽鎖を、第１０族元素、第１１族元素、及び第１２族元素からなる群より選択される１種以上の金属イオンとインキュベートした後、当該金属イオンを除去することにより、より高活性な抗体軽鎖を含有する組成物を安定的に得られることを見出し、発明を完成させた。
【０００９】
すなわち、本発明に係る抗体κ型軽鎖及びその製造方法は、下記〔１〕～〔１２〕である。
〔１〕酵素活性を有する又は酵素活性が向上した抗体κ型軽鎖の製造方法であって、
可変領域が、カバット分類で可変領域のＮ末端から９５番目のアミノ酸残基が、プロリン残基であるアミノ酸配列からなるポリペプチドである抗体κ型軽鎖をコードするポリヌクレオチドについて、前記プロリン残基が欠失又は置換するように改変して、可変領域が、カバット分類で可変領域のＮ末端から９５番目のアミノ酸残基が、欠失している又はプロリン残基以外のアミノ酸残基であるアミノ酸配列からなるポリペプチドである抗体κ型軽鎖をコードするポリヌクレオチドを得る改変工程と、
前記改変工程後の抗体κ型軽鎖をコードするポリヌクレオチドを含む発現用ベクターを用いて、細胞内又は細胞外発現系によって、酵素活性を有する抗体κ型軽鎖を発現させる発現工程と、
を含む、製造方法。
〔２〕前記抗体κ型軽鎖が、ヒト型又はマウス型である、〔１〕に記載の製造方法。
〔３〕前記酵素活性を有する又は酵素活性が向上した抗体κ型軽鎖の可変領域が以下の（１ａ）～（３ｃ）からなる群より選択されるポリペプチドである、〔１〕又は〔２〕に記載の製造方法。
（１ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列中のカバット分類でＮ末端から９５番目のプロリン残基が欠失又は置換されているアミノ酸配列からなるポリペプチド；
（１ｂ）前記（１ａ）のポリペプチドのアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換、付加若しくは欠失し、且つカバット分類で可変領域のＮ末端から９５番目のアミノ酸残基が、欠失している又はプロリン残基以外のアミノ酸残基であるアミノ酸配列からなるポリペプチド；
（１ｃ）前記（１ａ）のポリペプチドのアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有し、且つカバット分類で可変領域のＮ末端から９５番目のアミノ酸残基が、欠失している又はプロリン残基以外のアミノ酸残基であるアミノ酸配列からなるポリペプチド；
（２ａ）配列番号２で表されるアミノ酸配列中のカバット分類でＮ末端から９５番目のプロリン残基が欠失又は置換されているアミノ酸配列；
（２ｂ）前記（２ａ）のポリペプチドのアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換、付加若しくは欠失し、且つカバット分類で可変領域のＮ末端から９５番目のアミノ酸残基が、欠失している又はプロリン残基以外のアミノ酸残基であるアミノ酸配列からなるポリペプチド；
（２ｃ）前記（２ａ）のポリペプチドのアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有し、且つカバット分類で可変領域のＮ末端から９５番目のアミノ酸残基が、欠失している又はプロリン残基以外のアミノ酸残基であるアミノ酸配列からなるポリペプチド；
（３ａ）配列番号３で表されるアミノ酸配列中のカバット分類でＮ末端から９５番目のプロリン残基が欠失又は置換されているアミノ酸配列；
（３ｂ）前記（３ａ）のポリペプチドのアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換、付加若しくは欠失し、且つカバット分類で可変領域のＮ末端から９５番目のアミノ酸残基が、欠失している又はプロリン残基以外のアミノ酸残基であるアミノ酸配列からなるポリペプチド；
（３ｃ）前記（３ａ）のポリペプチドのアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有し、且つカバット分類で可変領域のＮ末端から９５番目のアミノ酸残基が、欠失している又はプロリン残基以外のアミノ酸残基であるアミノ酸配列からなるポリペプチド
〔４〕前記酵素活性を有する又は酵素活性が向上した抗体κ型軽鎖の可変領域が以下の（４ａ）～（７ｃ）からなる群より選択されるポリペプチドである、〔１〕～〔３〕のいずれか一つに記載の製造方法。
（４ａ）配列番号４で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；
（４ｂ）配列番号４で表されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換、付加若しくは欠失し、且つカバット分類で可変領域のＮ末端から９５番目のアミノ酸残基が、欠失している又はプロリン残基以外のアミノ酸残基であるアミノ酸配列からなるポリペプチド；
（４ｃ）配列番号４で表されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有し、且つカバット分類で可変領域のＮ末端から９５番目のアミノ酸残基が、欠失している又はプロリン残基以外のアミノ酸残基であるアミノ酸配列からなるポリペプチド；
（５ａ）配列番号５で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；
（５ｂ）配列番号５で表されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換、付加若しくは欠失し、且つカバット分類で可変領域のＮ末端から９５番目のアミノ酸残基が、欠失している又はプロリン残基以外のアミノ酸残基であるアミノ酸配列からなるポリペプチド；
（５ｃ）配列番号５で表されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有し、且つカバット分類で可変領域のＮ末端から９５番目のアミノ酸残基が、欠失している又はプロリン残基以外のアミノ酸残基であるアミノ酸配列からなるポリペプチド；
（６ａ）配列番号６で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；
（６ｂ）配列番号６で表されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換、付加若しくは欠失し、且つカバット分類で可変領域のＮ末端から９５番目のアミノ酸残基が、欠失している又はプロリン残基以外のアミノ酸残基であるアミノ酸配列からなるポリペプチド；
（６ｃ）配列番号６で表されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有し、且つカバット分類で可変領域のＮ末端から９５番目のアミノ酸残基が、欠失している又はプロリン残基以外のアミノ酸残基であるアミノ酸配列からなるポリペプチド；
（７ａ）配列番号７で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；
（７ｂ）配列番号７で表されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換、付加若しくは欠失し、且つカバット分類で可変領域のＮ末端から９５番目のアミノ酸残基が、欠失している又はプロリン残基以外のアミノ酸残基であるアミノ酸配列からなるポリペプチド；
（７ｃ）配列番号７で表されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有し、且つカバット分類で可変領域のＮ末端から９５番目のアミノ酸残基が、欠失している又はプロリン残基以外のアミノ酸残基であるアミノ酸配列からなるポリペプチド
〔５〕前記酵素活性を有する又は酵素活性が向上した抗体κ型軽鎖の可変領域が以下の（８ａ）～（８ｃ）からなる群より選択されるポリペプチドである、〔１〕又は〔２〕に記載の製造方法。
（８ａ）配列番号８で表されるアミノ酸配列中のカバット分類でＮ末端から９５番目のプロリン残基が欠失又は置換されているアミノ酸配列；
（８ｂ）前記（８ａ）のポリペプチドのアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換、付加若しくは欠失し、且つカバット分類で可変領域のＮ末端から９５番目のアミノ酸残基が、欠失している又はプロリン残基以外のアミノ酸残基であるアミノ酸配列からなるポリペプチド；
（８ｃ）前記（８ａ）のポリペプチドのアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有し、且つカバット分類で可変領域のＮ末端から９５番目のアミノ酸残基が、欠失している又はプロリン残基以外のアミノ酸残基であるアミノ酸配列からなるポリペプチド
〔６〕前記酵素活性を有する抗体κ型軽鎖の可変領域が以下の（９ａ）～（９ｃ）からなる群より選択されるポリペプチドである、〔１〕、〔２〕、〔５〕のいずれか一つに記載の製造方法。
（９ａ）配列番号９で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；
（９ｂ）配列番号９で表されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換、付加若しくは欠失し、且つカバット分類で可変領域のＮ末端から９５番目のアミノ酸残基が、欠失している又はプロリン残基以外のアミノ酸残基であるアミノ酸配列からなるポリペプチド；
（９ｃ）配列番号９で表されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有し、且つカバット分類で可変領域のＮ末端から９５番目のアミノ酸残基が、欠失している又はプロリン残基以外のアミノ酸残基であるアミノ酸配列からなるポリペプチド
〔７〕抗体κ型軽鎖をコードするポリヌクレオチドを含む発現用ベクターを用いて、細胞内又は細胞外発現系によって、前記抗体κ型軽鎖を発現させる発現工程と、
前記発現工程で得られた発現産物から、第１の充填剤を含むカラムを用いたカラムクロマトグラフィー法により、前記抗体κ型軽鎖を含む粗精製物を得る第１の精製工程と、
前記抗体κ型軽鎖を含む粗精製物に金属イオンを添加し、前記抗体κ型軽鎖と前記金属イオンとが結合した抗体κ型軽鎖複合体を含む粗精製物を得る添加工程と、
前記添加工程後の前記抗体κ型軽鎖複合体を含む粗精製物から、第２の充填剤を含むカラムを用いたカラムクロマトグラフィー法により、前記抗体κ型軽鎖複合体の精製物を得る第２の精製工程と、
前記第２の精製工程後の前記抗体κ型軽鎖複合体の精製物から前記金属イオンを除去して抗体κ型軽鎖の精製物を得る除去工程と、
を含む抗体κ型軽鎖の製造方法。
〔８〕前記除去工程をキレート剤の添加により行う、〔７〕に記載の抗体κ型軽鎖の製造方法。
〔９〕前記金属イオンが銅イオン、ニッケルイオン、亜鉛イオン、金イオン、銀イオン、及び白金イオンからなる群より選択される１種以上である、〔７〕又は〔８〕に記載の抗体κ型軽鎖の製造方法。
〔１０〕前記抗体κ型軽鎖は、可変領域が、カバット分類で可変領域のＮ末端から９５番目のアミノ酸残基が、欠失している又はプロリン残基以外のアミノ酸残基であるアミノ酸配列からなるポリペプチドである、〔７〕～〔９〕のいずれか一つに記載の抗体κ型軽鎖の製造方法。
〔１１〕前記発現工程前に、可変領域が、カバット分類でＮ末端から９５番目のアミノ酸残基が、プロリン残基であるアミノ酸配列からなるポリペプチドである抗体κ型軽鎖をコードするポリヌクレオチドについて、前記プロリン残基が欠失又は置換するように改変して、可変領域が、カバット分類で可変領域のＮ末端から９５番目のアミノ酸残基が、欠失している又はプロリン残基以外のアミノ酸残基であるアミノ酸配列からなるポリペプチドである抗体κ型軽鎖をコードするポリヌクレオチドを得る改変工程を更に含む、〔１０〕に記載の抗体κ型軽鎖の製造方法。
〔１２〕酵素活性を有さない抗体κ型軽鎖に酵素活性を付与する、又は抗体κ型軽鎖の酵素活性を向上させる方法であって、
前記酵素活性を有さない抗体κ型軽鎖の可変領域が、カバット分類で可変領域のＮ末端から９５番目のアミノ酸残基がプロリン残基であるアミノ酸配列からなるポリペプチドであり、
前記酵素活性を有さない抗体κ型軽鎖をコードするポリヌクレオチドを、前記プロリン残基が欠失又は置換するように改変することを含む、方法。
【発明の効果】
【００１０】
本発明に係る製造方法により得られる抗体κ型軽鎖は、従来の抗体κ型軽鎖よりも酵素活性が高いものであり、広く臨床適用可能な医薬品として期待できる。
また、本発明に係る抗体κ型軽鎖の製造方法により、高活性な抗体κ型軽鎖を安定的に製造することができる。
【図面の簡単な説明】
（【００１１】以降は省略されています）

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